周月玲

摘要：目的：建立喉癥丸中蟾酥的主要成分華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量測定方法，通過測定華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量對其質(zhì)量進行控制；方法：采用高效液相色譜法(HighPerformanceLiquidChromatography,HPL-C)，選用色譜柱為Hypersil-C18柱（250mm×4.6mm，5?m），流動相為乙腈-水（50:50）；柱溫為20℃，流速為0.5ml?min-1；測定波長為296nm；進樣量為10μL。結果：華蟾酥毒基進樣量在0.101~1.2625μg(r=0、999993)范圍內(nèi)線性關系良好;平均回收率(n=6)為99.07%,RSD為0.37%。酯蟾毒配基進樣量在0.10118~1.26475μg(r=0.999996)范圍內(nèi)線性關系良好;平均回收率(n=6)為99.137%,RSD為0.38%。結論：該方法簡便、靈敏、準確，利用高效液相色譜法測定喉癥丸中蟾酥的含量，可以為喉癥丸的定量分析建立標準?？捎糜诤戆Y丸的質(zhì)量控制。

關鍵詞：喉癥丸；蟾酥；華蟾酥毒基；酯蟾毒配基；HPLC

【中圖分類號】R 927 【文獻標識碼】B 【文章編號】1672-8602(2014)05-0294-02

1 前言

本文建立了喉癥丸中蟾酥含量測定的高效液相色譜法，該法具有分離效果好、實驗結果表明,本法簡便、快捷,準確度高,專屬性強,重現(xiàn)性好等優(yōu)點，可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

2 儀器與試藥

Agilent1200LC全自動高效液相色譜儀，G1311A四元泵，G1311A自動進樣器，G1316A柱溫箱，AgilentG1313A可變波長紫外檢測器，Agilent1200化學工作站；AL204型電子天平；MX5型百萬分之一電子天平；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；

乙睛為色譜純；甲醇為分析純；水為去離子水。

對照品：華蟾酥毒基對照品，脂蟾毒配基對照品。由中國藥品生物制品檢定所提供。

喉癥丸樣品由廣州白云山敬修堂股份有限公司提供。

3 方法與實驗

3.1 色譜適應性實驗：

色譜柱為HypersilODSC18柱（250mm×4.0mm，5μm，依利特），乙腈-水（50:50）為流動相，流速為0.5ml?min-1，檢測波長296nm，進樣量為10μl柱溫為20℃。理論塔板數(shù)應不低于4000。

3.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24h的華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品各50mg，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度制成每1ml含華蟾酥毒基50μg、脂蟾毒配基50μg的溶液，即得。

3.1.2 供試品溶液的制備：

取本品適量，研細，取0.6175g，精密稱定，置25ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，稱定重量，超聲提取1h，取出，放冷至室溫，再稱定重量，加甲醇補足減失重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

3.1.3 陰性對照溶液的制備：

取除去蟾酥的其他處方藥材，按樣品制備方法制成陰性樣品，按"3.1.2"項下方法制成陰性液。

分別取陰性對照溶液、對照品溶液、供試品溶液各10μL,按照上述色譜條件進樣測定,結果供試品溶液在與對照品溶液相同保留時間處有一致的色譜峰,華蟾酥毒基和脂蟾毒配基色譜峰與其他組分達到基線分離，陰性溶液在與對照品溶液相同的保留時間處無吸收峰，陰性樣品不干擾樣品測定。

A

B

C

A喉癥丸供試品液相色譜圖，B華蟾酥毒基與脂蟾毒配基對照液相色譜圖，C缺蟾酥陰性對照液相色譜圖

圖2.1 缺蟾酥陰性樣品、華蟾酥毒基與脂蟾毒配基對照品及喉癥丸HPLC色譜圖

3.2 方法學考察

3.2.1 線性范圍考察：

分別精密吸取華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品的混合溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25μl，按上述色譜條件測定峰面積，以對照品進樣量（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，經(jīng)線性回歸，得華蟾酥毒基回歸方程為：Y=37.319476X-0.528097，r=0.999993；脂蟾毒配基回歸方程為：Y=37.213288X-3.842857，r=0.999996。結果表明華蟾酥毒基在0.101~1.2625μg范圍內(nèi)線性關系良好；脂蟾毒配基在0.10118~1.26475μg范圍內(nèi)線性關系良好。結果見表1，圖1。

表1 華蟾酥毒基的線性范圍

進樣量（μl） 2 5 10 15 20 25

Y 75.10196 185.07298 372.14923 559.16516 747.03766 931.90411

回歸方程 Y=37.319476X-0.528097，r=0.999993

圖1 華蟾酥毒基與脂蟾毒配基校正曲線

3.2.2 精密度試驗：

精密吸取同一供試品溶液10μL,連續(xù)進樣6次,測得峰面積,計算華蟾酥毒基、酯蟾毒配基RSD分別為0.68%和0.62%。結果顯示華蟾酥毒基和脂蟾毒配基精密度良好。

〖HJ1.4mm〗

3.2.3 穩(wěn)定性試驗：

取同一供試品溶液分別于0、2、4、8、24h進樣10μl，測定華蟾酥毒基峰面積。24h內(nèi)基本無變化。測得華蟾酥毒基峰面積的平均值為462.77363，RSD為0.68%，脂蟾毒配基峰面積的平均值為206.937276，RSD為0.57%，其結果顯示喉癥丸中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.4 重復性試驗：

取同一批號（批號：H10033）喉癥丸按供試品溶液制備方法制備5份供試樣品，分按含量測定項下方法測定，測得華蟾酥毒基峰面積的平均值為464.1008，RSD為0.68%，脂蟾毒配基峰面積的平均值為209.0346，RSD為0.57%。

3.2.5 回收率試驗：

取批號為H10034的喉癥丸，粉碎為粉末約0.6175g，精密稱定，共6份，置帶塞的錐形瓶中，各精密加入濃度為0.125mg/mL的華蟾酥毒基和0.055mg/mL的脂蟾毒配基混合對照液10mL，按3.2.2供試液制備的方法制成加樣供試品溶液。測得樣品中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。分別計算回收率。

結果顯示華蟾酥毒基回收率為99.07%，RSD=0.37%<3%；脂蟾毒配基回收率為99.17%，RSD=0.38%<3%。試驗結果進一步表明所建立的方法加樣回收率較高，符合含量測定要求。

4 結果

本次實驗結果顯示，采用Agilent1200LC全自動高效液相色譜儀，HypersilODSC18柱（250mm×4.0mm，5μm，依利特）為色譜柱，乙腈-水（50:50）為流動相，流速為0.5ml?min-1，檢測波長為296nm，進樣量為10μl，柱溫為20℃，高效液相法測定喉癥丸中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。結果華蟾酥毒基進樣量在0.101~1.2625μg(r=0.999993)范圍內(nèi)線性關系良好;平均回收率(n=6)為99.07%,RSD為0.37%。酯蟾毒配基進樣量在0.10118~1.26475μg(r=0.999996)范圍內(nèi)線性關系良好;平均回收率(n=6)為99.17%,RSD為0.38%。而且該方法簡便快速重復性好，穩(wěn)定性高，精密度強。從理論上來說，HPLC法測得的結果準確可靠，減少了薄層掃描法提取過程中產(chǎn)生的誤差，縮短了提取時間，而且HPLC法具有較高的分離效率和較快的分析速度，分離出制劑中的蟾酥的含量，較好地控制了制劑的質(zhì)量；從企業(yè)的經(jīng)濟考慮，運用高效液相色譜法，提高了生產(chǎn)效率，方法簡便快速，縮短了提取時間，減少了試劑的用量，從而又降低了成本。故此方法可以作為喉癥丸中蟾酥含量測定的方法。

5 討論

本實驗中曾嘗試幾種不同型號的色譜柱,其結果供試品分離效果均不理想,干擾較大,兩組分保留時間相差較短,主峰拖尾較嚴重等問題。結果以本實驗中采用的HypersilODSC18柱分離效果為佳,雜質(zhì)峰不干擾華蟾酥毒基和醋蟾毒配基的峰形,且二者能達到完全分離,保留時間適中,取得了較滿意的分離效果。

根據(jù)文獻報道[10]，配制一定濃度的華蟾酥毒基對照品溶液、脂蟾毒配基對照品溶液及二者的混合對照品溶液,在200~400nm波長處進行掃描,結果表明：華蟾酥毒基對照品在294nm處有最大吸收,脂蟾毒配基對照品在298nm處有最大吸收,二者混合對照品在296nm處有最大吸收,故確定檢測波長為296nm。與文獻[3]報道一致。又根據(jù)中國藥典2010年版一部蟾酥含量測定項下規(guī)定蟾酥測定波長為296nm,況且在本實驗的預實驗中采用296nm作為檢測波長。試驗結果,表明在296nm處,輔料基本沒有干擾,故選用296nm波長來測定,結果靈敏、準確。

曾采用中國藥典測定蟾酥中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量的流動相0.5﹪磷酸二氫鉀-乙腈（50:50）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.2），結果華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的分離度不佳，且操作繁瑣。通過查閱文獻[16-20],發(fā)現(xiàn)曾有人采用甲醇-水-冰醋酸系統(tǒng)、乙腈-0.1%磷酸溶液系統(tǒng)和不同比例的乙腈-水系統(tǒng)。根據(jù)實驗條件，預實驗用乙腈-水（55:45）為流動相進行實驗分離度也未達到要求。后來通過參照文獻[21]和實驗結果的基礎上，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-水（50:50）時，華蟾酥毒基與脂蟾毒配基峰形對稱，分離完全，雜質(zhì)干擾少，基線平直，故采用乙腈-水（50:50）作為流動相。另外，使用乙腈作為流動相還有諸多好處：（1）乙腈HPLC吸收最?。ㄌ貏e是在短波長上?。?；（2）UV檢測中的梯度基線上乙腈HPLC級產(chǎn)生鬼峰少；（3）乙腈和甲醇分別用同樣的比率與水混合時,一般情況下,乙腈的洗脫能力強。

本試驗分別用甲醇回流及甲醇超聲方法進行提取。結果發(fā)現(xiàn)回流提取之后的供試品溶液與超聲提取的供試品溶液實驗結果并沒有明顯差別。而且采用甲醇超聲提取法，簡便，易行，提取效率并未下降且溶液易于濾過，故用該提取方法。

本實驗分別對超聲提取的時間進行了考察，對供試品溶液分別超聲處理20,30,60min按實驗項下方法制備所需溶液,并按色譜條件進行測定,結果表明，用甲醇超聲30min，提取效率較高并已提取完全，因此確定超聲提取時間為30min。

通過在不同的柱溫條件下進行試驗,開始用25℃進行試驗時發(fā)現(xiàn)華蟾酥毒基的色譜峰已經(jīng)分離完全，分離度高。但是脂蟾毒配基與旁邊的干擾峰分不開。經(jīng)過摸索發(fā)現(xiàn)柱溫20℃時分離度好,分離時間適中,可保證在正常時間內(nèi)完成檢測任務。

結束語

由于中藥成分比較復雜，使用高效液相色譜分析法作為其質(zhì)量控制的主要方法，這種測量方法分離效果好，分析速度快，靈敏度高，準確，操作自動化，簡單方便,是對中藥進行成分分析的一種極有價值的分析技術。實驗中也可以體驗到方法的優(yōu)勢。以前曾用TLC－UV法測定蟾酥的含量操作繁瑣，準確性差，所以采用高效液相色譜法，可以為喉癥丸的質(zhì)量控制提供了快速、準確的測定方法。

參考文獻

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