王旭群　趙華鋒　周嘉明　羅司玉

摘要：目的：建立以柱前衍生化高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測葡萄中單氰胺的含量；方法：衍生化試劑為丹磺酰氯，色譜柱為Waters BEH C18，流動(dòng)相為甲醇和0.1%甲酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.3mL /min，采用UPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）正離子模式測定，外標(biāo)法定量；結(jié)果：單氰胺最低檢測濃度為0.02mg/kg，在0.02，0.04，0.1mg/kg3個(gè)添加水平下，平均回收率為76%～86%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～3.0%。

關(guān)鍵詞：單氰胺 葡萄 柱前衍生化 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號(hào)：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2014）08-0061-02

單氰胺化學(xué)名稱為氨基氰，是良好的植物生長調(diào)節(jié)劑、殺菌劑、殺蟲劑、脫葉劑，可以打破葡萄類和落葉類水果的休眠期[1]，從而促使它們提前開花、結(jié)果和成熟，單氰胺在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用十分廣泛[2]。單氰胺在水果作物中的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致其可能殘留在水果中，單氰胺對人類健康有許多潛在的危害，GB 2763-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量中規(guī)定了葡萄中的最大殘留限量為0.05mg/kg，因此迫切需要葡萄中單氰胺的痕量檢測方法。

單氰胺分子量小、極性大、易揮發(fā)的特點(diǎn)，給單氰胺的檢測帶來了極大的困難。目前單氰胺的檢測還沒有國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于單氰胺殘留檢測方法的報(bào)道也很少[3]。本文首次建立了柱前衍生液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄中單氰胺殘留量的檢測方法，其靈敏度和精密度滿足殘留分析的要求，為評(píng)價(jià)葡萄的食用安全性提供了檢測依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

單氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（98%，上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；甲醇、丙酮、甲酸（均為色譜純）；碳酸鈉、碳酸氫鈉、丹磺酰氯（均為優(yōu)級(jí)純）；超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters I-Class液相- XEVO TQ質(zhì)譜）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；離心機(jī)（CTK80，湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；

1.2 儀器條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Waters UPLC BEH C18（50mm×2.1mm，1.7μm）；色譜柱溫度：40℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸/水；流動(dòng)相B：甲醇；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量：5μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子（ESI+）；母離子：276.2；定量離子：156.2；定性離子：171.2；錐孔電壓：32V；定量、定性離子的碰撞能量分別為30、20eV。

1.3 標(biāo)樣溶液的配制

精確稱取單氰胺標(biāo)準(zhǔn)品0.01g（精確至0.00001g），用水溶解并定容至100mL，制得100μg/mL標(biāo)樣溶液，備用。臨用前根據(jù)需要用50%甲醇/水稀釋成不同濃度的標(biāo)樣工作液。

1.4 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取5.00g已粉碎均勻的葡萄樣品于50mL的離心管中，加入25mL甲醇，均質(zhì)2min，10mL甲醇分兩次清洗均質(zhì)棒，5000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到 50mL的容量瓶中，并用甲醇定容到50mL，混勻，從容量瓶中準(zhǔn)確吸取5mL至10mL的具塞刻度試管中，加入2mL 0.1M碳酸鈉、碳酸氫鈉混合溶液，1mL1%丹磺酰氯丙酮溶液，混勻后50℃水浴振蕩反應(yīng)1小時(shí)，冷卻至室溫，用甲醇定容到10mL，混合均勻后用0.22μm的濾膜過濾，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的確定

2.1.1衍生化條件的確認(rèn)

由于單氰胺分子量小、極性大、易揮發(fā)的特點(diǎn)，導(dǎo)致單氰胺無法直接測定，因此必須進(jìn)行衍生化反應(yīng)后才能進(jìn)行檢測，本次實(shí)驗(yàn)嘗試采用可以和伯胺進(jìn)行反應(yīng)的丹磺酰氯作為衍生化試劑，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)LCMSMS分析測定。

2.1.2 凈化條件的確定

單氰胺結(jié)構(gòu)中含有氨基，屬于堿性化合物，而且極性較強(qiáng)，于是考慮采用MCX、C18、Carb固相萃取小柱進(jìn)行凈化，結(jié)果顯示MCX小柱回收率較低，保留作用較弱，而C18和Carb固相萃取小柱凈化效果較差，考慮效率和成本，采用稀釋后直接衍生化反應(yīng)，由于LCMSMS儀器靈敏度好，采取樣品稀釋20倍后上機(jī)測定，回收率較好，而且完全滿足限量值的要求。

2.2 儀器條件的確定

2.2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

衍生質(zhì)量濃度為0.5mg/L的單氰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，衍生產(chǎn)物分子量為275，質(zhì)譜通過針泵連續(xù)進(jìn)樣，采用MS SCAN方式進(jìn)行掃描，調(diào)節(jié)錐孔電壓，得到較強(qiáng)的[M+H]峰母離子276.2，對選定的母離子進(jìn)行子離子掃描，調(diào)節(jié)碰撞能量，得到豐度較好的2個(gè)子離子，分別為156.2、171.2，根據(jù)MRM的色譜峰形及靈敏度，確定156.2為定量離子，171.2為定性離子。

2.2.2 液相條件的優(yōu)化

單氰胺衍生后的化合物，極性減弱，可以采用反相色譜柱C18進(jìn)行分離。流動(dòng)相采用甲醇和0.1%甲酸/水，梯度洗脫，調(diào)整使保留時(shí)間適中且基質(zhì)影響小，最終確定梯度洗脫程序。

2.3 校準(zhǔn)曲線及最低檢測限

衍生單氰胺濃度為0.0002、0.001、0.005、0.02、 0.1mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以衍生產(chǎn)物的峰面積、質(zhì)量濃度為縱、橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，表明在0.0002～ 0.1mg/L濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（r2=0.9997），可以做定量分析。

對陰性葡萄樣品添加0.02mg/kg的濃度水平，信噪比S/N為18.5，所以最低定量檢測濃度定為0.02mg/kg。

2.4 回收率與精密度

在葡萄的空白試樣中添加0.02、0.04、0.1mg/kg三個(gè)濃度水平的單氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行5次平行測定，從結(jié)果看出單氰胺的平均回收率在78%～95%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～5.2%。

2.5 實(shí)際樣品的檢測

按照本方法，分別檢測了三種不同產(chǎn)地的葡萄樣品中單氰胺的殘留，結(jié)果表明葡萄中的單氰胺未檢出（<0.02mg/kg）。

3結(jié)語

本文建立了柱前衍生化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄中單氰胺殘留量的分析方法，速度快，準(zhǔn)確度高，靈敏度好，適用于單氰胺的安全性評(píng)價(jià)。