許淑芬，王英凱，馬寅芙，劉 磊，孫牧男，方艷秋，譚 巖＊

（1.吉林省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院胃腸內(nèi)科，吉林長春130021）

抑制IGFBP－2基因的表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響

許淑芬1，王英凱2，馬寅芙1，劉 磊1，孫牧男1，方艷秋1，譚 巖1＊

（1.吉林省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院胃腸內(nèi)科，吉林長春130021）

目的探討RNA干擾技術(shù)沉默胰島素生長因子結(jié)合蛋白2（IGFBP－2）對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251增殖、凋亡的影響，為膠質(zhì)瘤的基因治療提供一個(gè)可選擇的靶點(diǎn)和方法。方法構(gòu)建靶向IGFBP－2基因的RNAi表達(dá)載體；采用脂質(zhì)體法將siRNA轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，設(shè)非特異的siRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染siRNA的陰性對(duì)照組；采用RT－PCR法半定量檢測(cè)siRNA對(duì)IGFBP－2基因表達(dá)的抑制作用；用MTT法測(cè)定U251細(xì)胞增殖變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)siRNA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。結(jié)果構(gòu)建的RNAi表達(dá)載體抑制了IGFBP－2基因的表達(dá)（P＜0.01）；RNA干擾沉默IGFBP－2基因可抑制U251細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。結(jié)論在細(xì)胞水平上，構(gòu)建的靶向IGFBP－2的siRNA可明顯抑制IGFBP－2基因的表達(dá)，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率明顯上升（P＜0.01），為進(jìn)一步利用RNA干擾進(jìn)行膠質(zhì)瘤的基因治療研究奠定基礎(chǔ)。

RNA干擾；膠質(zhì)瘤；胰島素生長因子結(jié)合蛋白2；增殖；凋亡

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1572）

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的35%－60%。具有惡性度高、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差等臨床特點(diǎn)。膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，手術(shù)無法全切，需結(jié)合放療、化療、生物治療等綜合治療手段以延長患者生存期。近年來，國內(nèi)外隨著人們對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展研究的不斷深入，基因治療作為一種新型的腫瘤治療方法越來越受到人們的重視，且成為膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白－2（Insulinlike growth factor binding protein－2，IGFBP－2）是胰島素樣生長因子（Insulin－like growth factor， IGF）系統(tǒng)的成員之一，IGFBP－2主要在胎兒增生能力旺盛的組織中表達(dá)，出生后表達(dá)明顯下降。近幾年研究顯示，IGFBP－2在許多腫瘤中表達(dá)明顯升高，如膠質(zhì)瘤［1，2］、前列腺癌［3］、卵巢癌［4］、結(jié)腸癌［5］、乳腺癌［6］。并且隨腫瘤級(jí)別增加IGFBP－2的表達(dá)增高，IGFBP－2在腫瘤惡性進(jìn)展中起重要作用［2］。由此提示IGFBP－2可能作為腫瘤的診斷治療靶點(diǎn)。本研究依據(jù)RNA干擾原理［7］，以IGFBP－2基因?yàn)榘悬c(diǎn)，IGFBP－2高表達(dá)的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，構(gòu)建靶向IGFBP－2基因的RNAi表達(dá)載體，用lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，研究其特異抑制IGFBP－2基因表達(dá)、抑制U251細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的能力。

1 材料與方法

1.1 主要材料膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株、大腸桿菌DH5α、pSilencer2.1－U6neo載體本室保存；Trizol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；AMV Reverse transcriptase、Oligo（dT）15primers及RNasin Ribonuclease Inhibitor為Promega公司產(chǎn)品；Taq DNA–polymerase、T4DNA ligase、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、DNA Marker均為Takara公司產(chǎn)品；annexin V－FITC／PI凋亡試劑盒購于百奧生物；引物由賽百盛公司合成。

1.2 IGFBP－2siRNA、IGFBP－2、β－actin引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中報(bào)道的IGFBP－2的核苷酸序列（NM－000597），參考siRNA及引物的設(shè)計(jì)原則，利用Ambion公司siRNA在線設(shè)計(jì)軟件。從IGFBP－2核苷酸序列起始密碼子下游尋找符合設(shè)計(jì)特征的靶序列，篩選得到908－926nt 19bp片段為靶序列（siRNA的篩選另報(bào)道），設(shè)計(jì)的siRNA序列5’端和3’端分別引入BamHⅠ、HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，加入9bp的loop環(huán)結(jié)構(gòu)，3’末端加轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)TTTTTT。同時(shí)采用國際通用的與所有基因均無同源性的序列siRNA為陰性對(duì)照見表1。經(jīng)BlastSearch檢索確認(rèn)與IGFBP－2以外的人類已知基因序列無同源性。

基于這些關(guān)系表的頻繁挖掘方法可以采用直接連接的方法，形成一張大表。但是這種方法會(huì)導(dǎo)致性能低下、統(tǒng)計(jì)偏斜等問題。故本文利用關(guān)系數(shù)據(jù)庫的特點(diǎn)對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行改進(jìn)。算法主要包括如下4個(gè)步驟。

表1 針對(duì)IGFBP－2基因設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染合成的兩條互補(bǔ)siRNA鏈在退火緩沖液作用下退火，用T4連接酶連接于經(jīng)雙酶切（HindⅢ、BamH I）的質(zhì)粒pSilencer2.1－U6neo中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，隨機(jī)挑取菌落。接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩過夜，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒鑒定。取對(duì)數(shù)生長期的U251細(xì)胞接種于6孔板，密度達(dá)80%時(shí)，用lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6h以后更換含20%FBS培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h。G418篩選，收集G418抗性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為U251細(xì)胞對(duì)照組，U251轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染pSilencer2.1－U6 neo非特異質(zhì)粒的siRNA對(duì)照組，轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1－U6neo－IGFBP質(zhì)粒的目的siRNA實(shí)驗(yàn)組。

保定市力達(dá)塑業(yè)有限公司創(chuàng)建于1997年，作為華北地區(qū)專業(yè)生產(chǎn)塑料制品的公司，始終堅(jiān)持科技興企和管理興企的理念，一直致力于塑料管材產(chǎn)品的研發(fā)和制造，經(jīng)過17年的滾動(dòng)發(fā)展，現(xiàn)已形成集科研、生產(chǎn)、銷售于一體的現(xiàn)代化企業(yè)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)操作按照annexin V－FITC／PI凋亡試劑盒說明書進(jìn)行，將培養(yǎng)后細(xì)胞用PBS洗3次，加入annexin V－FITC／PI 20μl，室溫下避光孵育15min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

2.1 RT－PCR檢測(cè)IGFBP－2 mRNA表達(dá)轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1－IGFBP的U251細(xì)胞與3個(gè)對(duì)照組相比IGFBP－2mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而3個(gè)對(duì)照組（無關(guān)siRNA對(duì)照組、空載體對(duì)照組和U251細(xì)胞對(duì)照組）細(xì)胞中都存在較高水平的IGFBP－2mRNA表達(dá)，相互比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表2、圖1。

因此，在膨潤土MEL計(jì)算涉及的“三率”項(xiàng)中，選礦回采率高是普遍容易實(shí)現(xiàn)的，因此，選礦回收率權(quán)重值控制在30～35為宜，其中采用部分選礦的取30，不選的取35，膨潤土資源稟賦可直接加工。

1.4 RT－PCR檢測(cè)IGFBP－2 mRNA表達(dá)使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，參照Invitrogen公司說明操作，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，選擇β－actin作為內(nèi)參照。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min，然后95℃45s、55℃45s、72℃45 s，30個(gè)循環(huán)后再72℃延伸10min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描電泳結(jié)果。

2.2 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后U251細(xì)胞增殖的變化U251細(xì)胞增殖水平顯示，IGFBP－2RNAi組細(xì)胞在24h、48h、72h各時(shí)間點(diǎn)A值均明顯低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的各對(duì)照組（P＜0.01），各對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)A值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表3。

2 結(jié)果

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖變化取各組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化收集，調(diào)整單細(xì)胞懸液密度為2× 106·ml－1個(gè)。按每孔200μl（2×103個(gè)細(xì)胞）接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。置37℃5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第24h開始，每隔24h隨機(jī)取1塊96孔板，每孔加入5g·L－1MTT液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO。將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10min，使結(jié)晶物溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔A值，檢測(cè)波長為490nm，增殖抑制率＝（1－試驗(yàn)組A值／實(shí)驗(yàn)組A值）× 100%。

表2 IGFBP－2 mRNA相對(duì)表達(dá)量（n＝3，x—±s）

圖1 RT－PCR檢測(cè)IGFBP－2 mRNA表達(dá)

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析.計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x—± s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.水進(jìn)去約數(shù)十秒后就會(huì)到達(dá)全身每個(gè)角落，可以促進(jìn)細(xì)胞的新陳代謝，讓身體從睡眠中醒過來，有提神醒腦的功效；

表3 RNAi后不同時(shí)間各組U251細(xì)胞增殖力的變化（n＝3，x—±s）

2.3 轉(zhuǎn)染siRNA后U251細(xì)胞凋亡率的變化轉(zhuǎn)染后48h，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較各對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），各對(duì)照之間比較（P＞0.05）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U251細(xì)胞凋亡率

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。膠質(zhì)瘤目前首選手術(shù)治療，術(shù)后多采用放療、化療等綜合治療，但治愈率仍不理想，平均生存期約50周，因此如何提高膠質(zhì)瘤的早期診斷率，以及有效地促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡都是人們積極研究的方向；IGFBP－2同屬胰島素樣生長因子系統(tǒng)（insulin－like system，ICFs），是一類具有促有絲分裂活性的、參與組織生長和分化的生長因子家族，通過與1型和2型IGF受體（IGFR）相互作用，在不同的組織中刺激細(xì)胞增殖和抑制凋亡，從而與一些惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)［8］。Sallinen等［9］通過cDNA微陣列及組織芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，高度惡性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）中IGFBP－2高表達(dá)，其表達(dá)越高，預(yù)后越差。Elmlinger等［10］發(fā)現(xiàn)，大量表達(dá)IGFBP－2的細(xì)胞常聚集于腫瘤壞死灶附近，IGFBP－2與GBM形成和進(jìn)展密切相關(guān)。Muller［11］發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病人腦脊液IGFBP－2顯著升高。許多研究發(fā)現(xiàn)IGFBP－2血漿水平可預(yù)測(cè)高級(jí)別膠質(zhì)瘤的臨床結(jié)局［12，13］。且隨著IGFBP－2水平增高預(yù)后不良［14，15］。因此提示IGFBP－2可能作為膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)，通過降低IGFBP－2水平，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)其凋亡。

本研究設(shè)計(jì)了能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)靶向IGFBP－2基因的siRNA的質(zhì)粒并將其導(dǎo)人U251細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RNAi質(zhì)粒載體的導(dǎo)入明顯抑制了IGFBP－2mRNA的表達(dá)?？召|(zhì)粒組與空白對(duì)照組的結(jié)果差異無顯著性，排除了質(zhì)粒本身對(duì)基因的抑制作用。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的結(jié)果差異亦無顯著性，說明了RNAi的高度特異性。構(gòu)建的IGFBP－2RNAi載體轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后，MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示U251細(xì)胞的增殖率明顯降低，而凋亡比例顯著升高。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了以IGFBP－2為目的基因，通過RNAi技術(shù)可特異性地抑制其在人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的過度表達(dá)，并抑制U251細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，為未來腦膠質(zhì)瘤的基因治療打下了基礎(chǔ)。本研究只觀察了沉默IGFBP－2基因后U251細(xì)胞增殖率降低、凋亡比例升高，其機(jī)理及臨床可行性等有待進(jìn)一步研究。

［1］Fuller GN，Rhee CH，Hess KR.Reactivation of insulin－like growth factor binding protein 2expression in glioblastoma multiforme：a revelation by parallel gene expression profiling［J］.Cancer Res，1999，59：4228.

［2］Elmlinger MW，Deininger MH，Schuett BS，et al.In vivo expression of insulin－like growth factor－binding protein－2in human gliomas increases with the tumor grade［J］.Endocrinology，2001，142（4）：1652.

［3］Cohen P，Peehl DM，Stamey TA，et al.Elevated levels of insulinlike growth factor－binding protein－2in the serum of prostate cancer patients［J］.J Clin Endocrinol Metab，1993，76（4）：1031.

［4］Lancaster JM，Sayer RA，Blanchette C，et al.High expression of insulin－like growth factor binding protein－2messenger RNA in epithelial ovarian cancers produces elevated preoperative serum levels［J］.Int J Gynecol Cancer，2006，16（4）：1529.

［5］Mishra L，Bass B，Ooi BS，et al.Role of insulin－like growth factor－I（IGF－I）receptor，IGF－I，and IGF binding protein－2in human colorectal cancers［J］.Growth Horm IGF Res，1998，8（6）：473.

［6］Busund LT，Richardsen E，Busund R，et al.Significant expression of IGFBP2in breast cancer compared with benign lesions.［J］.J Clin Pathol，2005，58（4）：361.

［7］Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double－stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391（6669）：806.

［8］Chen JC，Shao ZM，Sheikh MS，et a1.Insulin－like growth factorbinding protein enhancement of insulin like growth factor－I（IGF－I）mediated DNA synthesis and IGF－I binding in a human breast carcinoma cell line.［J］.J Cell Physiol，1994，158：69.

［9］Sallinen SL，Sallinen PK，Haapasalo HK，et a1.Identification of differentially expressed genes in human gliomas by DNA microarray and tissue chip techniques［J］.Cancer Res，2000，60（23）：6617.

［10］Elmlinger MW，Deininger MH，Schuett BS，et a1.In vivo expression of insulin－like growth factor－binding protein－2in human gliomas increases with the tumor grade［J］.Endocrinology，2001，142（4）：1652.

［11］Muller HL，Oh Y，Lehrnbecher T，et a1.Insulin－like growth factor－binding protein—2concentrations in cerebrospinal fluid and serum of children with malignant solid tumors or acute leukemia［J］.J Clin Endocrinol Metab，1994，79（2）：428.

［12］Lin Y，Jiang T，Zhou K，et al.Plasma IGFBP－2levels predict clinical outcomes of patients with high－grade gliomas［J］.Neuro Oncol，2009，11（5）：468.

［13］李方成，戴學(xué)元，陶宗玉，等.胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白－2在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2004，21（5）：594.

［14］Yang P，Yan W，Zhang W，et al.Whole－genome messenger RNA profiling reveals genes involved in malignant progression of glioma［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2013，93（1）：5.

［15］Han S，Meng L，Han S，et al.Plasma IGFBP－2levels after postoperative combined radiotherapy and chemotherapy predict prognosis in elderly glioblastoma patients［J］.PLoS One，2014，9（4）：e93791.

Effects of RNA interference silencing IGFBP－2 gene on proliferation and apoptosis of human glioma U251 cells

XU Shu－fen，WANG Ying－kai，MA Yin－fu，et al.（Central Laboratory，Jilin Province People’s Hospital，Changchun130021，China）

ObjectiveTo investigate the effect of silencing IGFBP－2with RNA interference on the proliferation and apoptosis of the glioma U251cells，and to provide a viable method for the gene therapy of glioma.MethodsRNAi expression vector for IFGBP－2was constructed and transfected to U251cell with lipofectamin.RT－PCR method was used to detect the variation of IGFBP－2mRNA level.MTT method was used to measure the variation in the proliferation of U251cells.Flow cytometer was used to monitor cell apoptosis and changes.Results The construction of RNAi expression vector inhibited the expression of IGFBP－2mRNA；Silencing IGFBP－2gene with RNA interference could inhibit the proliferation of U251cells and induce the apoptosis of U251cells（P＜0.01）.ConclusionRNAi technique can effectively inhibit the expression of IGFBP－2gene（P＜0.01），hence inhibit the proliferation of U251cells and induce the apoptosis of U251cells.

RNA interference；glioma；IGFBP－2；Proliferation；Apoptosis

R730.264

A

許淑芬（1963－），女，吉林省長春市人，主任技師，主要從事免疫與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的研究。

2013－11－26）

1007－4287（2014）10－1572－04

吉林省科技廳項(xiàng)目資助課題，編號(hào)（201015220）

＊通訊作者