楊珍福，吳毅歆，陳映嵐，何月秋,2*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性應(yīng)用技術(shù)國(guó)家工程研究中心，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，

昆明 650201；3.微生物菌種篩選與應(yīng)用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，昆明 650217；4.云南省祿勸縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，云南 祿勸 651500）

煙草拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選與防病促生長(zhǎng)效果

楊珍福1，吳毅歆2,3，陳映嵐4，何月秋1,2*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性應(yīng)用技術(shù)國(guó)家工程研究中心，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，

昆明 650201；3.微生物菌種篩選與應(yīng)用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，昆明 650217；4.云南省祿勸縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，云南 祿勸 651500）

為了獲得能促進(jìn)煙草生長(zhǎng)和防治黑脛病的穩(wěn)定菌株，通過(guò)常規(guī)方法從煙草莖、葉中分離到 478 株內(nèi)生細(xì)菌，其中65 株能拮抗煙草黑脛病菌，占 13.60%。菌株 YN201408、YN201442、YN201448 和 YN201458 對(duì)煙草疫霉的抑菌率分別為63.85%、60.82%、64.72%和 76.07%，用 1.0×107cfu/mL 拮抗菌液浸煙苗根系 30 min，移栽后澆灌 1 次，在溫室盆栽試驗(yàn)中控病效果分別為 68.24%、65.47%、69.12 和 41.40%。YN201448 對(duì)煙草種子萌芽率和煙草的生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用，煙草的發(fā)芽率、第 5～6 真葉期苗高和地上部鮮重分別高于清水對(duì)照 10.95%、29.31%和 67.24%。依據(jù)菌體形態(tài)、生理生化特征和 16S rDNA序列，YN201408、YN201442 和 YN201448 鑒定為解淀粉芽孢桿菌，YN201458 為銅綠假單胞菌。YN201448 因良好的促生長(zhǎng)和控病效果而具有繼續(xù)開發(fā)應(yīng)用的潛力。

煙草；黑脛病菌；解淀粉芽孢桿菌；生物防治；促生長(zhǎng)

煙 草 黑 脛 病 是 由 煙 草 疫 霉 （ Phytophthora parasitica var. nicotianae）引起的煙草真菌性土傳病害之一。該病常與煙草青枯病混合發(fā)生，導(dǎo)致煙草矮化、萎蔫、葉片發(fā)黃、根和莖基部壞死，發(fā)病率3%～12%，重者損失達(dá) 50%[1-2]。目前除東北煙區(qū)零星發(fā)生外，我國(guó)其他煙草主栽區(qū)均普遍發(fā)生[3-4]。該病的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，但長(zhǎng)期反復(fù)施用，造成煙株藥害、農(nóng)藥殘留和病原菌產(chǎn)生抗藥性[5-6]。近年來(lái)，隨著煙草及煙草制品逐漸向更加安全化方向發(fā)展，生物防治已成為煙草病害防治研究的熱點(diǎn)。

關(guān)于植物病害生防細(xì)菌的篩選，過(guò)去主要是從土壤或植物根際土壤微生物中分離，但由于易受外界條件的影響，這些土壤微生物防病效果時(shí)常不穩(wěn)定[7]。近年來(lái)的研究表明，植物體是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，植株體內(nèi)廣泛分布大量?jī)?nèi)生細(xì)菌，其中許多內(nèi)生細(xì)菌不僅可以抑制病原菌的生長(zhǎng)，還具有促生、固氮等生物功能[8-9]，展示了很好的開發(fā)應(yīng)用前景。為得到良好內(nèi)生菌株，本研究開展了對(duì)煙草黑脛病菌有拮抗作用且具有促生作用的煙草內(nèi)生細(xì)菌的分離篩選和鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試材料

煙草黑脛病菌于 2012 年分離自玉溪煙區(qū)感病煙株，具強(qiáng)致病力。LB 培養(yǎng)基用于分離和保存內(nèi)生細(xì)菌，燕麥培養(yǎng)基用于培養(yǎng)煙草黑脛病菌和對(duì)峙培養(yǎng)。云煙 97 種子由云南省煙草公司提供，煙草在育苗基質(zhì)中培育至5～6片真葉備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草內(nèi)生細(xì)菌的分離 健康煙草莖、葉經(jīng)酒精消毒后，用滅菌水沖洗3次，于滅菌的研缽中研磨，將研磨汁液涂布于 LB 平板上。用印跡法[10]檢測(cè)樣品表面消毒是否徹底，如長(zhǎng)菌落，研磨液所涂平板上長(zhǎng)的菌落為非內(nèi)生細(xì)菌，棄去；若對(duì)照中無(wú)菌落，在研磨液中長(zhǎng)出的菌落可能是內(nèi)生細(xì)菌，隨機(jī)挑取形態(tài)不同的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)并保存[11]。

1.2.2 拮抗內(nèi)生細(xì)菌篩選 以煙草黑脛病菌為指示菌，采用燕麥平板對(duì)峙培養(yǎng)法[10]，在平板中央倒置直徑為 0.5 cm 的煙草黑脛病菌的瓊脂塊，再將分離到的細(xì)菌點(diǎn)接在距煙草黑脛病菌的瓊脂塊 3 cm處的 4 個(gè)角點(diǎn)上，置于 28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 7 d，選出對(duì)病原菌生長(zhǎng)有抑制作用的菌株進(jìn)入復(fù)篩。每個(gè)菌株3次重復(fù)，記錄并保存。將拮抗性好的菌株轉(zhuǎn)接5代以上，繼續(xù)觀察其對(duì)煙草黑脛病菌的抑菌作用，并測(cè)定其抑菌帶寬度。對(duì)抑菌效果好的菌株，采用抗利福平標(biāo)記法標(biāo)記菌株[8]，灌根[12]測(cè)定其在煙草內(nèi)的定殖能力。

1.2.3 拮抗內(nèi)生細(xì)菌對(duì)煙草黑脛病的溫室控病作用 溫室控病試驗(yàn)于 2013 年在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院溫室中進(jìn)行。挑選出抑菌圈較大且抑菌作用穩(wěn)定的拮抗菌，活化后在 37 ℃、170 r/min 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 3 d，用無(wú)菌水稀釋至 1.0×107cfu/mL。黑脛病菌采用鄭小波[13]方法，制備成濃度為 1.0×104個(gè)/mL游動(dòng)孢子懸液。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的 5～6 片真葉期的煙苗，移栽前將煙草幼苗在 1.0×107cfu/mL 濃度的相應(yīng)菌液中浸根 30 min，然后將煙苗移栽至盆中，空白對(duì)照采用清水浸根。3次重復(fù)，每重復(fù)5株煙苗。移栽 3 d 后用相應(yīng)拮抗菌懸液（1.0×107cfu/mL）灌根一次，對(duì)照澆等量清水。3 d 后將配制好的黑脛病游動(dòng)孢子菌懸液（104個(gè)/mL）灌接于各處理煙苗根部，接種量為 5 mL/株。溫室溫度 28 ℃，澆水保濕以利于發(fā)病。接種病原菌 20 d 后，調(diào)查各處理煙株的發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)、發(fā)病率和相對(duì)防效。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和防治效果計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[3,14]。

1.2.4 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的促生作用測(cè)定 （1）發(fā)芽率測(cè)定試驗(yàn) 云煙 97 種子經(jīng)酒精消毒后，用菌株YN201448 菌懸液（1.0×106cfu/mL）浸泡 24 h，取出種子置于墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于 28 ℃保濕培養(yǎng)，第7天時(shí)檢測(cè)種子的萌芽率。每皿處理 30粒種子，3次重復(fù)，用清水和 LB 液體培養(yǎng)基作對(duì)照。

（2）漂浮育苗試驗(yàn) 試驗(yàn)于 2013 年在云南省微生物發(fā)酵工程中心大棚內(nèi)進(jìn)行。煙草種子用YN201448 菌液進(jìn)行浸種處理，出芽后播種到裝有漂浮育苗基質(zhì)的育苗盤中，煙草出苗后用濃度為107cfu/mL 的 YN201448 菌液噴霧 1 次，待煙草長(zhǎng)到 5～6 片真葉時(shí)，測(cè)定株高、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬及地上部鮮重。每處理 50株，3次重復(fù)，用清水和LB液體培養(yǎng)基作對(duì)照。

1.2.5 生理生化與分子生物學(xué)鑒定 參照文獻(xiàn)[15]，對(duì) 4 株拮抗菌進(jìn)行生理生化特性的測(cè)定。菌株 YN201448 基因組總 DNA 的提取采用凍融法[16]。16S rDNA 基因片段的 PCR 擴(kuò)增采用由上海生工公司合成的細(xì)菌通用引物 P0（5′GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′）和 P6（5′- CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3′）。PCR 擴(kuò)增采用 20 μL 反應(yīng)體系：10×EasyTaq Buffer（含 Mg2+）2.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.6 μL，P0（10 mmol/μL）和 P6（10 mmol/μL)均為 1.0 μL，EasyTaq DNA Polymerase （5 U/μL，Transgene）0.2 μL，模板 DNA（10～50 ng/μL）0.5 μL，補(bǔ)充 ddH2O 至總體積 20 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃ 1 min ，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)，最后 72 ℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，目標(biāo)條帶切膠后，利用試劑盒回收，將回收后的 16S rDNA 片段連接到 pMD18-T 載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（E.coli）DH5α 中，以藍(lán)白斑特征挑取陽(yáng)性克隆，再以 PCR 驗(yàn)證陽(yáng)性克隆[17]。被確認(rèn)的克隆送至北京華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在 NCBI分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)同源性。結(jié)合形態(tài)、生理生化反應(yīng)及 16S rDNA 基因片段序列，鑒定菌株的分類地位。

2 結(jié) 果

2.1 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的分離與篩選結(jié)果

從采自玉溪、昆明的煙草莖、葉中共分離到 478株內(nèi)生細(xì)菌，包括從莖部分離到 358 株，從葉部分離到 120 株。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，478 株內(nèi)生細(xì)菌中有 65 株能拮抗煙草黑脛病菌，占總數(shù) 13.60%，但它們都來(lái)自煙草莖稈。其中，YN201408、YN201442、YN201448 和 YN201458 等有較強(qiáng)的抑菌作用（圖1），對(duì)煙草疫霉的抑菌率分別為 63.85%、60.82%、64.72%和 76.07%。各菌株在轉(zhuǎn)移 5 代后，其抑菌能力無(wú)明顯變化。另外，煙草幼苗經(jīng)利福平標(biāo)記菌株菌液分別灌根處理后，在含利福平的 LB培養(yǎng) 基上 均能 從植 株 里 分 離 到 YN201408 、YN201442、YN201448 和 YN201458 細(xì)菌，而清水處理中未獲得細(xì)菌。各回收菌株的基本形態(tài)和原菌株相同，測(cè)定菌株對(duì)煙草黑脛病菌的抑制作用也與原菌株接近，表明這4 個(gè)菌株均能在煙株體內(nèi)定殖。

圖1 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)煙草黑脛病病原菌生長(zhǎng)的抑制Fig. 1 The effect of endophytic bacteria on growth of Phytophthora parasitica var. nicotianae

2.2 溫室控病試驗(yàn)

溫室控病試驗(yàn)中，拮抗內(nèi)生菌菌液處理煙草幼苗后，煙草黑脛病發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于空白對(duì)照，溫室盆栽防治效果達(dá) 41.40%～69.12%（表1）。對(duì)照煙苗發(fā)病嚴(yán)重，植株生長(zhǎng)受到抑制；經(jīng)拮抗菌懸液處理的煙苗發(fā)病程度較輕，植株生長(zhǎng)發(fā)育正常（圖2）。4 個(gè)菌株處理中，YN201448 菌液處理的防效最高，達(dá)到 69.12%。

表1 拮抗內(nèi)生細(xì)菌對(duì)煙草黑脛病的溫室防治效果Table 1 The effect of antagonistic endophytic bacteria on control tobacco black shank in the greenhouse

2.3 拮抗細(xì)菌懸液對(duì)煙草苗期促生作用的測(cè)定

圖2 YN201448 菌株對(duì)煙草黑脛病的溫室防治效果Fig. 2 The effect of YN201448 against tobacco black shank in greenhouse

從表2 可以看出，煙草種子經(jīng) YN201448 菌液處理后，發(fā)芽率高達(dá) 97.33%，顯著高于清水和 LB培養(yǎng)液處理的發(fā)芽率 87.67%和 89.00%，分別高于后兩者 9.66%和 8.33%。在漂浮育苗試驗(yàn)中，在煙草 5～6 葉期，YN201448 菌液處理的煙草苗高 15.31 cm，地上部分鮮重 3.88 g，亦顯著高于清水和 LB培養(yǎng)液處理的苗高 11.84 cm 和 11.63 cm，地上部分鮮重 2.32 g 和 2.74 g，其中苗高分別高于后兩者29.31%和 31.64%，鮮重分別高出 67.24%和 41.61%。YN201448 菌液處理的煙草株高、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬和地上部分鮮重顯著優(yōu)于對(duì)照（圖3）。菌株YN201448 處理的煙草幼苗長(zhǎng)勢(shì)明顯好于對(duì)照，葉片寬厚、葉色更為濃綠，表明 YN201448 不僅能有效促進(jìn)煙草種子萌發(fā)而且對(duì)煙草生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用。

表2 YN201448 菌液對(duì)煙苗生長(zhǎng)的影響Table 2 The effect of antagonistic endophytic bacterium YN201448 on tobacco seedling growth

圖3 YN201448 處理的煙苗Fig. 3 Seedlings treated with YN201448

2.4 生理生化與分子鑒定結(jié)果

生理生化試驗(yàn)鑒定了 YN201408、YN201442、YN201448 和 YN201458 等4 個(gè)拮抗菌株的 12 個(gè)生理生化特征（表3）。其中 YN201408、YN201442和 YN201448 的革蘭氏染色、芽孢染色、淀粉水解、葡萄糖利用、檸檬酸鹽利用、V-P 試驗(yàn)、硝酸鹽還原、明膠液化等均呈陽(yáng)性；而 YN201458 菌株的KOH 反應(yīng)、葡萄糖利用、檸檬酸鹽利用、V-P 試驗(yàn)、明膠液化等呈陽(yáng)性，其余反應(yīng)均為陰性。根據(jù)形態(tài)特征和生理生化特性測(cè)定，初步確定 YN201408、YN201442、YN201448 為芽孢桿菌，YN201458 為假單胞菌。對(duì)提取的細(xì)菌基因組 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到了約為 1500 bp 的明亮條帶（圖4）。YN201408、YN201442 和 YN201448 菌株的 16S rDNA 序列經(jīng)與 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù) BLAST 比對(duì)，與其同源性較高的菌株均屬于芽孢桿菌屬，其中菌株YN201448 與 Bacillus amyloliquefaciens CC178（CP006845.1）、B. amyloliquefaciens subsp. plantarum str. FZB42(CP00560.1)、 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum AS43.3 相似度均達(dá) 99%，菌株 YN201408 和 YN201442 均與 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum CAUB946（HE617159）和 B. amyloliquefaciens LFB112（CP006952）相似度達(dá) 98%，而菌株 YN201458 與Pseudomonas aeruginosa CNU082141（ KF979144.1 ）、 P. aeruginosa CNU082137（ KF979142.1 ） 和 P. aeruginosa C1501（KF976394.1）等的相似度都達(dá)到 99%。結(jié)合菌株的形態(tài)特征，生理生化特性及 16S rDNA 序列，將YN201408、YN201442 和 YN201448 鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），YN201458鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

表3 四種拮抗菌株的生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Identification of 4 antagonistic bacteria in morphology, biology, and biochemistry

圖4 四株拮抗菌的 PCR 擴(kuò)增圖Fig. 4 The agarose gel electrophoresis of 4 antagonistic bacteria

3 討 論

生物防治已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有害生物防治的一項(xiàng)重要措施。很多相關(guān)試驗(yàn)表明，生防菌對(duì)煙草黑脛病具有一定的防治效果。趙秀香等[18]研究發(fā)現(xiàn)側(cè)孢短芽孢桿菌對(duì)煙草黑脛病菌有拮抗作用；易有金等[19]研究發(fā)現(xiàn)，短短芽孢桿菌對(duì)煙草黑脛病具有顯著防治效果。在植物病害生防中，若將防病作用與促生作用相結(jié)合，可起到更理想的效果[20]。目前，已 有學(xué)者[20-22]對(duì)防病促生的內(nèi)生菌進(jìn)行研究，但絕大多數(shù)研究成果都還沒(méi)有應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

在平板和溫室拮抗測(cè)定試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，平板拮抗活性較高的菌株在溫室也呈現(xiàn)出防效較高的趨勢(shì)，但也有些菌株例外。如本研究中菌株 YN201458 在平板對(duì)峙試驗(yàn)中有很好的抑菌活性，但其在盆栽試驗(yàn)中防效低于 YN201448，表明拮抗細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性直接影響到其對(duì)有害生物的控制效果[21]，即拮抗菌對(duì)煙草黑脛病菌的拮抗能力并不等同于防治能力，因此篩選拮抗菌時(shí)應(yīng)采用平板對(duì)峙與溫室防效及田間試驗(yàn)相結(jié)合的方法。

4 結(jié) 論

本研究從煙草中分離獲得 478 株內(nèi)生細(xì)菌，其中有 13.60%在平板上對(duì)煙草黑脛病菌有抑制作用，四株內(nèi)生細(xì)菌在盆栽試驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的防病效果，且具有促生作用。本研究通過(guò)室內(nèi)篩選、盆栽試驗(yàn)和漂浮育苗試驗(yàn)，篩選到1株對(duì)煙草黑脛病有較好防治效果且顯著促生作用的解淀粉芽孢桿菌YN201448，展現(xiàn)出了用于種子包衣、制作煙草漂浮育苗基質(zhì)和微生物肥料及藥劑的應(yīng)用前景。在盆栽試驗(yàn)中，它對(duì)黑脛病的防治效果達(dá) 69.24%。特別值得一提的是，煙苗是處在高接種菌量和有利于發(fā)病的接種室中，在田間條件下，病菌孢子量不可能達(dá)到 104個(gè)/mL 劑量。然而，YN201448 在田間控病效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Screening, Growth Promotion, and Disease Control of Antagonistic and Endophytic Bacteria in Tobacco

YANG Zhenfu1, WU Yixin2,3, CHEN Yinglan4, HE Yueqiu1,2*
（1. National Engineering Center for Applied Techniques of Agricultural Biodiversity, Yunnan Agricultural University(YAU), Kunming 650201, China; 2. College of Agronomy and Biotechnology, YAU, Kunming 650201, China; 3. National and Local Joint Engineering Research Center for Screening and Application of Microbial Strains, Kunming 650217, China; 4. Extension Station of Agricultural Techniques, Luquan County, Luquan, Yunnan 651500, China）

To obtain stable bacterial strains with good growth promotion of tobacco and black shrank disease control effect, 478 endophytic bacterial strains were isolated from tobacco leaves and stems. Among them 65 of strains ( accounting for 13.60%) could inhibit Phytophthora parasitica var. nicotianae by the traditional methodology. Especially, the four strains, YN201408, YN201442, YN201448 and YN201458 inhibited 63.85%, 60.82%, 64.72% and 76.07% of mycelia growth of the pathogen and controlled 68.24%, 65.47%, 69.12 and 41.40% of disease severity by soaking the seedling root in 1.0×107cfu/mL of the bacterial suspension for 30 min and drenching once after transplanting in the pot experiment in the greenhouse, respectively. YN201448 could promote seed germination and growth of tobacco, showing 10.95%, 29.31% and 67.24% higher than water control in germination rate, seedling height during 5-6 leaf stage and fresh weight on the ground. YN201408, YN201442 and YN201448 were classified into Bacillus amyloliquefaciens, and YN201458 into Pseudomonas aeruginosa based on their morphology, physiological and biochemical traits and 16S rDNA sequences. YN201448 showed good potential for application based on its growth promotion and disease control effect.

tobacco; Phytophthora parasitica var. nicotianae; Bacillus amyloliquefaciens; biocontrol; growth promotion

S572.08

1007-5119（2014）06-0048-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.06.010

科技部國(guó)際科技合作項(xiàng)目（2009DFA32360）；昆明市科技局項(xiàng)目（09H130301）

楊珍福，女，碩士研究生，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail：ynjcyzf152@126.com。*通信作者，E-mail：ynfh2007@163.com

2014-04-21

2014-08-13