曹建敏，于衛(wèi)松，黃 建，郭承芳，方 松，夏冰冰,2，姜振玲,2，邱 軍*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081；3. 江西中煙工業(yè)有限責任公司，南昌 330096）

烤煙致香物質(zhì) GC/MS 指紋圖譜在產(chǎn)區(qū)識別中的應用

曹建敏1，于衛(wèi)松1，黃 建3，郭承芳1，方 松1，夏冰冰1,2，姜振玲1,2，邱 軍1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081；3. 江西中煙工業(yè)有限責任公司，南昌 330096）

為研究 GC/MS 指紋圖譜在烤煙產(chǎn)區(qū)識別中的應用，實驗采用同時蒸餾萃取烤煙中香氣物質(zhì)，GC/MS 檢測，構建了湖南、廣西、貴州3個產(chǎn)區(qū)烤煙的致香物質(zhì)標準指紋圖譜。隨機選取這3個產(chǎn)區(qū)及廣東、河南的部分烤煙樣品對建立的標準指紋圖譜進行驗證。結果表明，驗證樣品與其所屬產(chǎn)區(qū)的標準指紋圖譜相似度較高，而與其他產(chǎn)區(qū)標準指紋圖譜的相似度較低，從而能準確的識別其所屬產(chǎn)區(qū)。將幾個產(chǎn)區(qū)烤煙樣品的指紋圖譜進行系統(tǒng)聚類分析，不同產(chǎn)區(qū)的烤煙能夠很好的聚合到一類，表明構建的指紋圖譜能夠反映不同產(chǎn)區(qū)烤煙的風格特色，進一步驗證了利用 GC/MS 指紋圖譜結合系統(tǒng)聚類法對樣品進行產(chǎn)區(qū)識別及風格特色定位的可行性。

烤煙；致香物質(zhì)；聚類分析；指紋圖譜；產(chǎn)區(qū)識別

我國煙區(qū)幅員遼闊生態(tài)多樣，使得不同產(chǎn)區(qū)的煙葉風格各異[1-2]，煙葉原料是發(fā)展“中式卷煙”的重要基礎[3-4]。通過將不同產(chǎn)區(qū)煙葉進行組合配比，可以調(diào)制出風格迥異的卷煙產(chǎn)品。目前，行業(yè)對煙葉風格特色的定位、評價主要依靠感官評吸，易受評吸主觀影響，評價結果往往存在差異。指紋圖譜技術是近些年來出現(xiàn)的控制中藥材質(zhì)量的較好方法之一，以指紋圖譜作為中藥（天然藥物）提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法[5-10]，已成為國際共識。本研究旨在借助指紋圖譜技術，建立起不同產(chǎn)區(qū)煙葉的標準指紋圖譜，并結合系統(tǒng)聚類分析的模式識別，用于指導、篩選和鑒定煙葉產(chǎn)區(qū)。

目前的研究表明，煙草致香物質(zhì)對煙草的風格特色有著十分重要的影響[11-13]，為了尋找不同香型特色煙葉的特征化學成分，中國煙葉公司 2010 年啟動了“特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)”重大專項，將“煙葉香型風格的特征化學成分研究”項目作為專項重要研究內(nèi)容。但由于形成香氣的物質(zhì)非常復雜，要從眾多成分中，找出影響煙葉風格特色的關鍵物質(zhì)，實非易事，目前尚未確定不同風格特色煙葉的獨特化學成分。煙草指紋圖譜技術，為從整體上評價煙草風格特色提供了一種新技術，因此，探索烤煙致香物質(zhì)指紋圖譜技術，從“整體性”、“模糊性”的角度對煙葉的風格特色定位，進而實現(xiàn)煙葉樣品的產(chǎn)區(qū)識別，有著積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 實驗材料 實驗所用烤煙樣品為 2012 年采收，等級均為 C3F，采自湖南（郴州、永州）、廣西（河池、百色）、貴州（遵義、畢節(jié)）、廣東（南雄）和河南（三門峽）5個產(chǎn)區(qū)。二氯甲烷為色譜純，氯化鈉、無水硫酸鈉均為分析純。

1.1.2 實 驗 儀 器 氣 質(zhì) 聯(lián) 用 儀 ： Agilent 7890A-5975C；同時蒸餾萃取裝置（安徽天長華玻公司）；氮吹儀（美國 OA 公司）；BS214S 天平（德國 Sartorius）；水浴鍋，電熱套。

1.2 實驗方法

1.2.1 致香物質(zhì)測定 致香物質(zhì)的檢測采用同時蒸餾萃取-氣相色譜質(zhì)譜法（GC/MS）[14-15]。

1.2.2 相似度計算 采用相關系數(shù)法計算樣品指紋圖譜與標準指紋圖譜的相似度，計算公式參照曹建敏等[14]的方法。

1.2.3 感官評吸 由中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所評吸委員會參照 GB 5606.4—2005 卷煙第 4 部分[16]感官技術要求，對實驗所用烤煙樣品卷制的單料煙進行評吸，并對單料煙香型進行評判。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 運用 DPS 13.5 軟件進行。

2 結 果

2.1 不同產(chǎn)區(qū)烤煙致香物質(zhì)標準指紋圖譜建立

不同產(chǎn)區(qū)烤煙一般都具有不同的風格特色，因此，不同產(chǎn)區(qū)的烤煙樣品即使經(jīng)感官評吸評判的香型相同，其風格特色也不盡相同。從湖南、廣西、貴州 3 個產(chǎn)區(qū) 2012 年采收烤煙樣品中，根據(jù)評吸結果選取以上3個產(chǎn)區(qū)具有代表性的樣品，其中湖南 25 個，香型以濃偏中、中偏濃和濃香型為主，廣西 25 個，香型以中偏濃、濃偏中為主，貴州 25個，香型以中偏清、清偏中、中間型為主，共 75個樣品。按照 1.2.1 方法進行處理，通過 GC/MS 做全掃描，根據(jù)譜庫檢索結果，選擇匹配率大于 800的色譜峰共 130 個，在選擇離子模式下進行檢測，對各樣品的 GC/MS 結果進行分析，其中 75 個樣品具有 124 個共有峰（除內(nèi)標），將這 124 個共有峰做相關性分析，將相關系數(shù)大于 0.70 的色譜峰合并，得到 101 個特征峰，參照文獻[17]方法計算相對保留時間和相對峰面積。將這 101 個特征峰作為特征指紋峰，得到了這 75 個樣品的致香物質(zhì)指紋圖譜，利用平均數(shù)法，分別得到這3個產(chǎn)區(qū)的烤煙標準指紋圖譜。

2.2 不同產(chǎn)區(qū)烤煙致香物質(zhì)指紋圖譜相似度評價

將選取的烤煙樣品的指紋圖譜看做是以 101 個特征峰為維數(shù)，以相對峰面積為物質(zhì)含量的空間 101維向量，分別計算 3個產(chǎn)區(qū)烤煙樣品與所屬產(chǎn)區(qū)及其他 2 個產(chǎn)區(qū)烤煙標準指紋圖譜的相似度（表1）。

將每個產(chǎn)區(qū)中所有樣品與該產(chǎn)區(qū)標準指紋圖譜的類內(nèi)相似度最小值定義為閾值，由此可知，湖南、廣西、貴州地區(qū)烤煙標準指紋圖譜的閾值分別為 0.751、0.755、0.759。這樣以來，在鑒別不同產(chǎn)區(qū)烤煙樣品時，分別計算未知樣品與3個產(chǎn)區(qū)標準指紋圖譜的相似度，再將每個相似度值跟與之相對應的產(chǎn)區(qū)閾值進行比較，如果相似度值大于閾值，就認為該未知樣品屬于這個產(chǎn)區(qū)，反之，就不屬于該產(chǎn)區(qū)。從表1可以看出，除廣西8號樣品與湖南烤煙標準指紋圖譜的類間相似度值略大于湖南地區(qū)標準指紋圖譜的閾值外，其他3個產(chǎn)區(qū)與另外兩個產(chǎn)區(qū)的類間相似度均小于其類內(nèi)相似度的閾值。這說明建立的3個產(chǎn)區(qū)的標準指紋圖譜能夠將不同產(chǎn)區(qū)的烤煙樣品區(qū)分開來。

表1 湖南、廣西、貴州 3 產(chǎn)區(qū)建標樣品與 3 產(chǎn)區(qū)標準指紋圖譜程度相似度結果Table 1 The similarity degree of fingerprint of flue-cured tobacco from different areas

2.3 不同產(chǎn)區(qū)烤煙指紋圖譜驗證

為了驗證3個產(chǎn)區(qū)標準指紋圖譜在產(chǎn)區(qū)識別中的可行性和準確性，從湖南、廣西、貴州、河南、廣東選取 20 個具有產(chǎn)區(qū)代表性的烤煙樣品，其中湖南 3 個（評吸結果判定香型為中偏濃）、廣西 3個（評吸結果判定香型為中偏濃），貴州 4 個（評吸結果判定為中間香型）、廣東 5 個（評吸結果判定為濃香型）、河南 5 個（評吸結果判定為濃偏中），按照 1.2.1 和 2.1 方法進行處理，得到 20 個烤煙樣品的特征指紋圖譜，分別計算這 20 個樣品指紋圖譜與3個產(chǎn)區(qū)標準指紋圖譜的相似度值，如表2所示，再結合 3 個產(chǎn)區(qū)的閾值，可以得出，1#、2#、3#為湖南產(chǎn)區(qū)樣品，4#、5#、6#為廣西產(chǎn)區(qū)樣品，7#、8#、9#、10#為貴州產(chǎn)區(qū)樣品，11#～20#與 3 個產(chǎn)區(qū)標準指紋圖譜相似度均低于其閾值，因此不屬于這3個產(chǎn)區(qū)。由驗證結果可以看出，每個樣品與其所屬產(chǎn)區(qū)的標準指紋圖譜相似度較高，而與其他產(chǎn)區(qū)標準指紋圖譜的相似度較低，從而準確的識別出其所屬產(chǎn)區(qū)。

2.4 不同產(chǎn)區(qū)烤煙樣品系統(tǒng)聚類分析

對湖南、廣西、貴州 75 個建標樣品，廣東、河南 10 個驗證樣品，共計 85 個烤煙樣本的 101 個特征峰，相對參比峰的峰面積進行量化，得到85*101 價原始數(shù)據(jù)矩陣，運用 DPS 軟件，對數(shù)據(jù)標準化后，采用絕對值距離，離差平方和聚類方法，進行聚類分析。圖1為系統(tǒng)聚類譜系圖，由圖1可以看出，不同產(chǎn)區(qū)烤煙樣品能夠很好的聚合到一起，界限較為明顯，與指紋圖譜的判斷結果基本一致。當 85 個樣品分為兩大類時，湖南、廣東、河南、廣西的 60 個樣品聚為一類，貴州的 25 個樣品聚為一類，說明貴州烤煙樣品與其他4個產(chǎn)區(qū)烤煙風格特色差異較大。表明構建標準指紋圖譜的致香物質(zhì)種類能夠反映不同產(chǎn)區(qū)烤煙的風格特色，從而更好的驗證了利用致香物質(zhì)指紋圖譜對樣品進行產(chǎn)區(qū)識別和風格特色評價的可行性。

表2 不同產(chǎn)區(qū)烤煙指紋圖譜驗證Table 2 Verification of fingerprint of flue-cured tobacco from different areas

圖1 不同地區(qū)烤煙系統(tǒng)聚類分布圖Fig. 1 Hierarchical clustering dendrogram of fingerprint of flue-cured tobacco from different areas

3 討 論

本研究通過借鑒中藥質(zhì)量控制研究領域指紋圖譜技術，建立了湖南、廣西、貴州3個產(chǎn)區(qū)烤煙致香物質(zhì)標準指紋圖譜，分別計算這3個產(chǎn)區(qū)烤煙樣品與所屬產(chǎn)區(qū)及其他兩個產(chǎn)區(qū)烤煙標準指紋圖譜的類內(nèi)和類間相似度值，相似度結果越大表明該樣品與標準指紋圖譜的相似程度越高。從相似度計算結果可以看出，每個產(chǎn)區(qū)內(nèi)樣品與該產(chǎn)區(qū)標準指紋圖譜的類內(nèi)相似度值較高，而與其他產(chǎn)區(qū)標準指紋圖譜的類間相似度值偏低，說明同一產(chǎn)區(qū)烤煙樣品的風格特色相似程度較高，而與其他產(chǎn)區(qū)差異較大。將每個產(chǎn)區(qū)建標樣品與該產(chǎn)區(qū)標準指紋圖譜的類內(nèi)相似度最小值定義為閾值，分別計算未知樣品與3個產(chǎn)區(qū)標準指紋圖譜的相似度，再將相似度值跟與之相對應的產(chǎn)區(qū)閾值進行比較，可以對烤煙樣品的產(chǎn)地進行識別。

文中又選取了湖南、廣西、貴州、廣東、河南5個產(chǎn)區(qū)共20個烤煙樣品對湖南、廣西、貴州3個產(chǎn)區(qū)的標準指紋圖譜進行驗證。結果表明，除廣西8號樣品與湖南烤煙標準指紋圖譜的類間相似度值略大于湖南地區(qū)標準指紋圖譜的閾值外，其他3個產(chǎn)區(qū)與另外兩個產(chǎn)區(qū)的類間相似度均小于其類內(nèi)相似度的閾值，另外，驗證樣品與其所屬產(chǎn)區(qū)的標準指紋圖譜相似度較高，而與其他產(chǎn)區(qū)標準指紋圖譜的相似度較低，從而能準確的識別出其所屬產(chǎn)區(qū)，將不同產(chǎn)區(qū)的烤煙樣品區(qū)分開來。

在中藥原材料質(zhì)量控制中，聚類分析、主成分分析等化學模式識別可作為相似度評價方法的有益補充，從而更客觀的評價中藥內(nèi)在質(zhì)量的真實性和一致性[18]，目前這種研究方法在石斛蘭和靈芝的質(zhì)量控制和產(chǎn)地識別中都有應用[19-20]。本研究運用系統(tǒng)聚類分析對 85 個烤煙樣品的指紋圖譜進行了模式識別，從系統(tǒng)聚類譜系圖可以看出，不同產(chǎn)區(qū)烤煙由于具有不同的風格特色，能夠很好的聚合到一類，分析結果與相似度評價軟件計算結果一致。

4 結 論

本研究建立的烤煙致香物質(zhì) GC/MS 指紋圖譜方法，能夠有效的對烤煙產(chǎn)區(qū)進行識別，從而將不同產(chǎn)區(qū)的烤煙樣品區(qū)分開來。此外，將指紋圖譜的相似度評價方法結合系統(tǒng)聚類的化學模式識別，可以直觀的顯示各個產(chǎn)區(qū)烤煙的分布，對不同煙區(qū)烤煙進行空間識別，從而進一步驗證了利用致香物質(zhì)指紋圖譜對烤煙樣品進行產(chǎn)區(qū)識別和風格特色評價的可行性。

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Application of Aroma Component GC/MS Fingerprint in Identifying Producing Areas of Flue-cured Tobacco

CAO Jianmin1, YU Weisong1, HUANG Jian3, GUO Chengfang1, FANG Song1, XIA Bingbing1,2, JIANG Zhengling1,2, QIU Jun1*
(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266101, China; 2.Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China; 3. China Tobacco Jiangxi Industrial Co., Ltd., Nanchang 330096, China)

In order to explore the potential of identifying flue-cured tobacco producing areas and controlling leaf quality by using GC/MS fingerprint, SDE combined with GC/MS was used to construct three standard fingerprints on aroma component of flue-cured tobacco from three areas (Hunan, Guangxi and Guizhou). Random samples from the 3 areas were used to tested and samples from Guangdong and Henan were used to verify the standard fingerprints. The results showed that there was high similarity among samples in the same producing area for the 3 areas, while low similarity was exist among samples from different areas. The sample similarity from Guangdong, Henan with the other 3 areas were lower than the threshold value of the standard fingerprint. It suggested that the system could discriminate effectively producing areas of flue-cured tobacco. Hierarchical cluster analysis was also carried out to analyze the aroma component of the flue-cured tobacco. The results showed that it was basically the same as the fingerprint identification results, which further proved the feasibility of identification of the producing areas and the characteristic of flue-cured tobacco based on GC/MS fingerprint and combined hierarchical cluster analysis.

flue-cured tobacco; aroma component; hierarchical cluster analysis; fingerprint chromatography; origin discrimination

S572.01

1007-5119（2014）06-0085-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.06.017

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項資助（201203091）

曹建敏，女，碩士，助研，研究方向為煙草化學與煙草質(zhì)量評價。E-mail：caojianmin11@163.com。*通信作者，E-mail：qjun1975@126.com

2014-05-29

2014-11-27