劉愛武 耿 松

（沛縣畜牧獸醫(yī)站，江蘇徐州 221600）

禽霍亂又稱為禽出血性敗血癥或禽巴氏桿菌病，由多殺性巴氏桿菌引起[1]。多殺性巴氏桿菌病在鴨、雞、鵝、火雞等家禽中易發(fā)，尤其鴨易感，對未接種禽霍亂疫苗的鴨致病率很高，日死亡率可達10%以上。個別接種禽霍亂疫苗的鴨有時仍可以感染多殺性巴氏桿菌而發(fā)病。本病常呈現(xiàn)急性經(jīng)過，發(fā)病率和死亡率均較高。2007年9月，沛縣某養(yǎng)殖戶共飼養(yǎng)麻鴨約1 000 只，38日齡，出現(xiàn)急性死亡，每天死亡達30只左右，持續(xù)3～4 d，用環(huán)丙沙星等藥物無效。經(jīng)做細菌分離和鑒定，依據(jù)藥敏試驗選擇藥物，病情得到了控制。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

（1）麥康凱瓊脂（Mackonkey agar，蛋白胨20 g，乳糖10 g，氯化鈉5 g，牛膽鹽5 g，中性紅0.025 g，瓊脂粉20 g，加蒸餾水1 000 ml，pH7.3+0.2）。

（2）DHL瓊脂（蛋白胨20 g，牛肉膏3 g，乳糖 10 g，蔗糖10 g，去氧膽酸鈉1 g，硫代硫酸鈉 2.3 g，檸檬酸鈉1 g，檸檬酸鐵銨1 g，中性紅0.03 g，瓊脂18～20 g，蒸餾水1 000 ml）。

（3）血瓊脂（pH7.4～7.6豆粉瓊脂100 ml，脫纖維羊血（或兔血）5～10 ml，加熱溶化瓊脂，冷至50 ℃，以滅菌手續(xù)加入脫纖維羊血，搖勻，傾注平板）。

1.2 試劑

（1）革蘭氏染色液：

① 草酸銨結(jié)晶紫染液（A液：結(jié)晶紫（crystal violet）2 g，95%乙醇20 ml；B液：盧戈（Lugol）碘液（碘片1 g，碘化鉀2 g，蒸餾水300 ml，先將碘化鉀溶解于少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘全部溶解后，加足水分即成）。

②95%的乙醇溶液。

③番紅復(fù)染液（番紅2.5 g，乙醇100 ml；取上述配好的番紅乙醇溶液10 ml與80 ml蒸餾水混合均勻即成）。

（2）美藍染色液（美藍 0.3 g，95%乙醇，30 ml，0.01%氫氧化鉀溶液，100 ml，將美藍溶解于乙醇中，然后與氫氧化鉀溶液混合）。

1.3 藥敏試紙

慶大霉素（10 μg/片）、四環(huán)素（30 μg/片）、磺胺異惡唑（300 μg/片）、痢特靈（300 μg/片）、左氟沙星（5 μg /片）、淋必治（壯觀霉素）（100 μg/片）、頭孢他啶（30 μg /片），購自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 生化發(fā)酵管

葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、木糖、鼠李糖、甘露醇、水楊苷、尿素、硫化氫、等微量生化發(fā)酵管，為杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.5 SPF雞

SPF雞由揚州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點開放實驗室提供。

1.6 肝臟觸片

取下肝臟，先用鑷子夾持其中部，然后以滅菌的剪刀取一小塊，夾出后將其新鮮的切面在玻片上壓印，自然干燥，火焰固定，美蘭染色，鏡檢。

1.7 細菌分離

將剪刀在酒精燈上灼燒后輕觸肝、表面滅菌，剪刀再次消毒，剪開滅菌區(qū)的肝，用接種環(huán)插入肝組織內(nèi)取樣接種于血液瓊脂平板上。在有氧的環(huán)境下，置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，24～48 h后觀察結(jié)果。

1.8 革蘭氏染色鏡檢

用接種環(huán)挑取一環(huán)生理鹽水蘸于潔凈玻片上，再用接種環(huán)挑取少量純培養(yǎng)的細菌與玻片上的生理鹽水混合，并均勻涂布于玻片上，自然干燥；待干燥后，在玻片上滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，作用1～3 min，水洗；后加革蘭氏碘液于玻片上媒染，作用1 min，水洗；再加95%酒精脫色，作用15～30 s，水洗；最后加番紅復(fù)染液復(fù)染1 min，水洗，自然干燥后鏡檢，觀察細菌形態(tài)特征。

1.9 美蘭染色

用接種環(huán)挑取一環(huán)生理鹽水蘸于潔凈玻片上，再用接種環(huán)挑取少量純培養(yǎng)的細菌與玻片上的生理鹽水混合，并均勻涂布于玻片上，自然干燥；在已干燥固定好的玻片上，滴加適量的美蘭染色液，經(jīng)過1～2 min，水洗，干燥，鏡檢。

1.10 細菌純化培養(yǎng)

挑取單個菌落在血液瓊脂培養(yǎng)基上再進行分區(qū)劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h。連續(xù)純培養(yǎng)3代，得到細菌的純培養(yǎng)物，同時進行革蘭氏染色鏡檢。挑取單個菌落于麥康凱瓊脂平板和DHL瓊脂平板上，放入37 ℃烘箱倒置培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果，

1.11 生化試驗

無菌操作，用接種環(huán)取純培養(yǎng)的待檢菌接種于各糖類微量發(fā)酵管中，倒置后于37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h觀察結(jié)果。若細菌能分解此種糖類產(chǎn)酸，則指示劑呈酸性變化，發(fā)酵管中顏色發(fā)生改變；不分解此種糖類，則無顏色變化；產(chǎn)氣可使倒置的小管內(nèi)出現(xiàn)氣泡。

1.12 藥敏試驗

挑取純培養(yǎng)后的單個菌落，均勻涂布到血液瓊脂平板的表面，然后將痢特靈、四環(huán)素等7種常用抗生素的藥敏試紙分別貼到血液瓊脂平板表面，先一塊平板中央放藥敏試紙一張，外周均勻分布6張，37 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈大小，根據(jù)標(biāo)準進行判定。（高敏：抑菌圈直徑大于15 mm；中敏：抑菌圈直徑為10～15 mm；低敏：抑菌圈直徑小于10 mm）

1.13 動物實驗

用生理鹽水稀釋純培養(yǎng)細菌，接種于2只SPF雞，分別肌注0.2 ml，另取2只SPF雞分別注射0.2 ml生理鹽水作為對照，觀察其癥狀。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷

病鴨表現(xiàn)為不愿下水，精神差，縮頭彎翅，口腔和鼻腔有粘液流出，呼吸困難，張口伸勁，搖頭。食欲降低，飲欲增加，有部分鴨癱瘓，不能行走。病死鴨剖檢可見肝臟腫大，密布較多白色壞死點（圖1），心肌嚴重出血（圖2），肺淤血，水腫。膽囊充盈、腫大。腹膜、皮下組織和腹部脂肪有出血點。肝臟觸片美蘭染色，鏡檢可見兩極濃染的細小短桿菌。

圖1 肝臟表面可見大量針尖大小壞死點

圖2 心臟表面可見出血斑塊

2.2 細菌分離

接種于血液瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后可形成1 mm左右濕潤水滴樣，邊緣整齊，表面光滑，淡灰白小菌落，不溶血；在麥康凱培養(yǎng)基、DHL瓊脂培養(yǎng)基上不生長。分離純化后的細菌經(jīng)過革蘭氏染色鏡檢后觀察，視野中可見大量兩極濃染的細小短桿菌（圖3）。

圖3 可見兩極濃染的細小短桿菌（×1 000）

2.3 生化試驗

本株細菌可以發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、蔗糖，不發(fā)酵乳糖、水楊苷、尿素、鼠李唐，不能夠液化明膠，產(chǎn)生硫化氫。生化試驗結(jié)果符合多殺性巴氏桿菌生化特征。

2.4 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果（表1）顯示，分離到的巴氏桿菌對四環(huán)素、磺胺異惡唑、左氟沙星、痢特靈、慶大霉素、頭孢他啶高度敏感，對壯觀霉素中度敏感。

表1 藥敏試驗結(jié)果（mm）

2.5 動物實驗

接種細菌的2只SPF雞于18 h死亡，而注射生理鹽水的2只SPF雞未出現(xiàn)異常癥狀。解剖后發(fā)現(xiàn)胸部皮下、肌肉可見膠凍樣滲出，腿肌出血，心冠脂肪有出血點，肝臟上可見針尖大小白色壞死點，膽囊未見明顯的病理變化。肝臟觸片美蘭染色后鏡檢可見兩極濃染的細小短桿菌。

3 小結(jié)與討論

通過臨床診斷，結(jié)合細菌的培養(yǎng)特性，生化試驗，以及菌體特征的觀察，表明所分離到的細菌為多殺性巴氏桿菌，診斷該鴨群暴發(fā)禽霍亂。與禽霍亂相關(guān)的多殺性巴氏桿菌的致病力或毒力比較復(fù)雜，而且常常發(fā)生變化，這主要取決于菌株差異、宿主本身的抵抗力及兩者之間接觸的條件。鴨對禽霍亂是高度易感的，該菌平時存在鴨體的消化道與呼吸道中，鴨體健康時，細菌與鴨體保持平衡狀態(tài)，不引起發(fā)病，當(dāng)機體的抵抗力下降或者環(huán)境因素改變時，這種平衡即被打破，疾病流行[7]。

通過藥敏試驗表明所分離的多殺性巴氏桿菌對四環(huán)素、磺胺異惡唑、左氟沙星、痢特靈、慶大霉素、頭孢他啶均表現(xiàn)高度的敏感性，對壯觀霉素表現(xiàn)出中度的敏感性。藥敏試驗中該菌株對左氟沙星是高度敏感，但是本病例用環(huán)丙沙星治療效果較差，可能與藥物用量、藥物的含量與純度不足有有關(guān)系。臨床用藥上，比較科學(xué)的用藥方法是先對致病菌加以分離，通過藥敏試驗篩選最佳抗菌藥物，最大程度的減少抗生素的濫用現(xiàn)象，防止耐藥菌株的產(chǎn)生和擴散而造成更大的經(jīng)濟損失。但是，在實際的臨床用藥中，由于實際生產(chǎn)條件的局限性，或由于某些疾病發(fā)病呈現(xiàn)急性經(jīng)過、急性死亡，從降低經(jīng)濟損失的角度出發(fā)，可根據(jù)流行病學(xué)、病理變化等做出的初步診斷，即給予藥物治療。依據(jù)本病例中疾病的流行特點、臨床癥狀、病理變化做出初步判斷為巴氏桿菌病，給以磺胺五甲氧嘧啶進行治療，病情得到控制。

多殺性巴氏桿菌在多種家禽中易發(fā)，雞、鴨和鵝易感，依據(jù)本病的流行特點，可采取如下防制措施：（1）加強飼養(yǎng)管理，改善家禽的養(yǎng)殖環(huán)境。（2）定期進行驅(qū)蟲，給與合理的營養(yǎng)，防止?fàn)I養(yǎng)缺乏。（3）依據(jù)天氣情況，注意保溫通風(fēng)。（4）加強消毒，輪換使用消毒藥，確保消毒效果。（5）夏季做好滅蚊驅(qū)蟲工作，減少傳播媒介。（6）加強免疫，由于多殺性巴氏桿菌具有多種莢膜血清型，選用疫苗時要加以注意。（7）將發(fā)病鴨和無癥狀鴨隔離飼養(yǎng)，保證充足的清潔飲水，添加維生素C、葡萄糖以保證能量需要及代謝平衡[8]。

[1]焦庫華.禽病的臨床診斷與防治[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2003：193-196.

[2]王永坤，朱國強，金山，等.水禽病診斷與防治手冊[M].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002：74-81.

[3]唐廣文.禽病識別與防治手冊[M].江西科學(xué)技術(shù)出版社，2000：123-126.

[4]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：248-252.

[5]崔忠道.雞鴨鵝飼養(yǎng)與疾病防治新技術(shù)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：273-275.

[6]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：131-134.

[7]劉麗穎，賀文琦，陸慧君，等.鵝巴氏桿菌病的病原分離鑒定及其病理學(xué)觀察[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2007，28（10）：33-37.

[8]徐大節(jié).雛鴨暴發(fā)巴氏桿菌病的診斷與防治措施[J].家禽科學(xué)，2007，（4）：30.