熊國蓮，陳驥，范陵，石菡，袁媛，鄒愚，楊軍，胡章勇

（成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染科，成都 610500）

乙型肝炎病毒（HBV）感染人體后主要表現(xiàn)為急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化及乙肝相關(guān)性肝癌等不同臨床疾病譜。HBV主要受機(jī)體遺傳、病毒及環(huán)境因素的交互作用影響，其中人體免疫因素起主要作用，某些與機(jī)體免疫應(yīng)答相關(guān)的關(guān)鍵基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）影響HBV感染后結(jié)局［1，2］。近年來，不同地域?qū)W者證實(shí)了 HLA－DPB1基因3＇非編碼區(qū)的rs9277535、rs9277542及 HLADPA1基因rs3077等位點(diǎn)與亞洲人群對(duì)HBV易感性及慢性HBV感染者表面抗原的血清學(xué)轉(zhuǎn)換密切相關(guān)［3－7］，但是這些位點(diǎn)多態(tài)性是否影響慢性 HBV感染者的疾病進(jìn)展仍存在較大的分歧。本研究擬對(duì)成都地區(qū)漢族人群中rs9277542位點(diǎn)的基因多態(tài)性與HBV感染后表現(xiàn)為不同臨床疾病譜的相關(guān)性進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

參照2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)《慢性乙型肝炎防治指南》，收集成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2009年4月～2013年4月期間579例無血緣關(guān)系的慢性HBV感染者作為病例組，包括慢性HBV攜帶者222例，其中男136例，女86例，平均（35.9±11.5）歲；慢性乙型肝炎患者231例，其中男157例，女74例，平均（40.8±13.6）歲；乙肝肝硬化126例，其中男102例，女24例，平均（50.4±10.6）歲。另選取 HBV自限性感染者344例（簡(jiǎn)稱自限性感染組）作為對(duì)照組，其中男167例，女177例，平均（41.59±14.43）歲。對(duì)照組均無肝病史，具有曾感染HBV證據(jù)（HBsAb、HBeAb和HBcAb 3種抗體至少2種陽性，HBsAg、HBeAg和 HBV DNA均為陰性）且未經(jīng)治療而恢復(fù)者。

1.2 基因分型

1.2.1 白細(xì)胞DNA的提取 抽取患者靜脈血3 mL，采用TIANamp blood DNA kit血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，Nanodrop分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度，每份標(biāo)本稀釋至終濃度10 ng／mL，放入－20℃冰箱備用。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增及純化 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì) PCR 引 物，序 列：5′－CAAATCAAGTTTAGT GCCCTCA－3′（上 游 引 物 ），5′－GCTGCTGTGCA CTGATTGTGTG－3′（下 游 引 物），產(chǎn) 物 575bp。PCR反應(yīng)條件：95℃2min預(yù)變性，然后94℃變性20s，65℃退火40s，72℃延伸1.5min，共11個(gè)循環(huán)；94℃ 20s，59 ℃ 30s，72 ℃ 1.5min，72 ℃ 2 min，共24個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用蝦堿酶及外切酶Ⅰ（ExoⅠ）純化。

1.2.3 SNapshot技術(shù)進(jìn)行rs9277542基因分型采用美國ABI公司的SNaPshot試劑盒進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。SNapshot PCR反應(yīng)體系10μL，其中純化PCR產(chǎn)物2μL，SNapshot Multiplex Kit 5μL，引物1μL，雙蒸水2μL。反應(yīng)條件：96℃10s，52℃5 s，60℃30s，共28個(gè)循環(huán)。SNaPshot引物序列：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTTTTGCGT CTCATATTGACACCTTT。取0.5μL SNapshot純化產(chǎn)物上樣于ABI 3130XL測(cè)序儀測(cè)序，利用GeneMapper 4.1軟件進(jìn)行分析。所有檢測(cè)樣本在完成第1次檢測(cè)后隨機(jī)抽取5%樣本進(jìn)行重測(cè)，一致性100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用在線軟件 DeFinetti program （http：／／ihg.gsf.de／cgi－bin／hw／hwa1.pl）作 病 例 組 和 對(duì) 照 組Hardy－Weinberg平衡檢測(cè)。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組樣品的基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。二分類logistic回歸分析計(jì)算經(jīng)年齡和性別矯正的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度的比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

利用χ2檢驗(yàn)對(duì)579例慢性HBV感染者和344例HBV自限性感染者HLA－DPB1基因rs9277542位點(diǎn)多態(tài)性作Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)，結(jié)果均符合 Hardy－Weinberg遺傳平衡（P＞0.05）。

2.2 兩組rs9277542基因型和等位基因頻率分布

CC、CT、TT及C、T等位基因頻率在兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）。對(duì)照組T等位基因及CT、TT基因型頻率明顯高于病例組。以C等位基因、CC基因型為對(duì)照，T等位基因、XT基因型為保護(hù)基因型（見表1）。

2.3 病例組不同亞組間rs9277542基因型分布頻率比較

CC、CT、TT 3種基因型在慢性HBV攜帶者組和慢性乙型肝炎組間分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表2）。CC、TT基因型頻率在慢性HBV攜帶者組、慢性乙型肝炎組與乙肝肝硬化組間的分布經(jīng)性別和年齡校正后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表3、表4）。

表1 自限性感染組與慢性HBV感染組rs9277542基因型和等位基因頻率分布

表2 慢性HBV攜帶者組與慢性乙型肝炎組rs9277542基因型分布

表3 慢性HBV攜帶者組與乙肝肝硬化組rs9277542基因型分布

表4 慢性乙型肝炎組與乙肝肝硬化組rs9277542基因型分布

3 討論

有研究表明，HLA－DP基因多態(tài)性與中國漢族人群慢性 HBV 感染及乙型肝炎重癥化有關(guān)［5，8，9］。O＇Brien等［10］證實(shí)，在分子水平上，HLA－DP mRNA低水平表達(dá)是發(fā)生HBV持續(xù)感染的重要原因。Thomas等［11］報(bào) 道，與 rs9277542 緊 密 連 鎖 的HLA－DPB1基因 rs9277534（G／A）多態(tài)性影響HLA－DP蛋白表達(dá)，攜帶主要基因型（G／G）人群外周血單核細(xì)胞表面HLA－DP蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于變異基因型（A／A）人群，并認(rèn)為低水平 HLA－DP表達(dá)促進(jìn) HBV自發(fā)清除。

本研究結(jié)果提示：成都地區(qū)漢族人群 HLADPB1基因rs9277542位點(diǎn)多態(tài)性與感染HBV后自發(fā)清除HBV密切相關(guān)，其中攜帶T等位基因和CT、TT基因型者有更高概率發(fā)生HBV自發(fā)清除，與Nishida等［7］在日本人和韓國人中所作的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）結(jié)論一致。考慮HLA－DP分子在乙肝病毒抗原提呈、病毒清除過程中發(fā)揮重要作用，并可能參與了慢性乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展過程，本研究對(duì)病例組按不同疾病狀態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：與慢性HBV攜帶者組和慢性乙型肝炎組比較，乙肝肝硬化組患者的CC、TT基因型的分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝硬化組的TT及TT＋CT基因型頻率顯著高于慢性HBV攜帶者組和慢性乙型肝炎組，提示在成都地區(qū)漢族人群中，HLA－DPB1基因不僅參與HBV感染后自發(fā)清除的過程，還可能與慢性HBV感染者進(jìn)展到肝硬化有關(guān)。

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