孟云輝 于慧卿 王 強(qiáng) 李武衛(wèi) 劉曉燕

(河北省石家莊市中醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

四妙勇安湯合生脈飲對(duì)缺氧乳鼠心肌細(xì)胞活性及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的影響※

孟云輝 于慧卿 王 強(qiáng) 李武衛(wèi) 劉曉燕

(河北省石家莊市中醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

目的 觀(guān)察四妙勇安湯合生脈飲對(duì)缺氧乳鼠心肌細(xì)胞活性及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的影響。方法 應(yīng)用醇沉技術(shù)制備四妙勇安湯合生脈飲藥液，采用胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合消化的方法分離SD乳鼠心肌細(xì)胞，采取2次差速貼壁法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行純化，原代培養(yǎng)。利用高純氮?dú)饨⑿募〖?xì)胞缺氧/復(fù)氧模型。原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照組、模型組及藥物干預(yù)組。采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞活性，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液AST的含量。結(jié)果 藥物干預(yù)組能提高乳鼠心肌細(xì)胞OD值，降低AST含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 四妙勇安湯合生脈飲可能提高缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞的活性，降低AST含量，從而對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

四妙勇安湯;生脈飲;心肌疾病;肌細(xì)胞，心臟;模型，動(dòng)物;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

近年來(lái)實(shí)驗(yàn)研究顯示，四妙勇安湯具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)血管新生的作用［1］。部分臨床試驗(yàn)表明，四妙勇安湯加味對(duì)冠心病及急性心肌梗死患者療效確切［2］。生脈飲臨床主要用于冠心病心肌梗死、心力衰竭及各種休克的治療。四妙勇安湯合生脈飲是否能夠起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用很少報(bào)道，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察四妙勇安湯合生脈飲對(duì)缺氧乳鼠心肌細(xì)胞活性及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的影響，以為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD乳鼠20只，出生24 h以?xún)?nèi)，SPF級(jí)，雌雄不限，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):1308037。

1.1.2 藥材及試劑 四妙勇安湯合生脈飲藥物組成:金銀花 30 g，玄參 30 g，當(dāng)歸 15 g，甘草 6 g，人參 9 g，麥門(mén)冬9 g，五味子6 g。中藥材由河北省石家莊市中醫(yī)院中藥房提供。胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)，Ⅱ型膠原酶(美國(guó)Sigma公司)，AST試劑盒(上海豐匯醫(yī)用儀器有限公司)。

1.1.3 主要儀器 311型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝)，酶標(biāo)儀(奧地利TECAN公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液制備 按上方準(zhǔn)確稱(chēng)取每味中藥，加入13倍的去離子水2 925 mL(即1 g生藥加13 mL去離子水)，浸泡30 min后，急火煎煮1.5 h，16層紗布過(guò)濾，濾出藥渣，隔水濃縮至生藥濃度為2.65 g/mL的藥液，此時(shí)(60℃)藥液相對(duì)密度為1.21 g/mL。冷卻后加無(wú)水乙醇，使含醇量達(dá)75%，充分?jǐn)嚢瑁?℃沉淀24 h，濾取上清，水浴濃縮成稠膏。檢測(cè)pH值7.1～7.2，密封，4℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)加培養(yǎng)液稀釋成生藥濃度為133 μg/mL的使用液，細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后使用。

1.2.2 SD乳鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞方法及鑒定 用75%酒精消毒SD乳鼠皮膚，組織剪剖開(kāi)胸部，換組織鑷取下心臟，置入盛有預(yù)冷的D-hanks液的培養(yǎng)皿中，換組織剪與組織鑷，輕輕洗去心臟上的血細(xì)胞，剪取心尖部，再用預(yù)冷的D-hanks液漂洗2～3次，洗凈殘血直至組織塊變白，置入青霉素小瓶中，剪成大小約1 mm3小塊。用0.08%胰蛋白酶與0.1%Ⅱ型膠原酶(等量混勻)消化，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾去除未消化的組織及細(xì)胞團(tuán)后，離心沉淀收集細(xì)胞，選擇700～1 000 r/min，離心5 min，所獲細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基懸浮;再經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，再離心1次，加適量完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 分組及給藥方法 將原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為3組。正常對(duì)照組:不進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，也不加四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液進(jìn)行干預(yù);模型組:進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，但不加四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液干預(yù);藥物干預(yù)組:進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，同時(shí)進(jìn)行四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液干預(yù)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)正常對(duì)照組更換完全培養(yǎng)基入培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h;模型組及藥物干預(yù)組更換無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)液，缺氧培養(yǎng)4 h，隨后模型組更換完全培養(yǎng)基，藥物干預(yù)組更換含有10%四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液的完全培養(yǎng)基，復(fù)氧2 h，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠糜趯?shí)驗(yàn)。

1.3 觀(guān)察指標(biāo)及方法

1.3.1 四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞活性

將心肌細(xì)胞接種于96板中，每孔200 μL，細(xì)胞密度3×105/mL。參照1.2.3項(xiàng)分組分別建立96孔板中缺氧模型并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。每組均設(shè)8個(gè)復(fù)孔。將MTT溶液配成終濃度為0.5 mg/mL的使用液。缺氧/復(fù)氧結(jié)束后，棄去96孔板中的培養(yǎng)液，用D-hanks液輕輕地沖洗2次，每孔加入MTT溶液100 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。取出培養(yǎng)板棄去原MTT溶液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL溶解沉淀，微量振蕩器振蕩15～20 min。在酶標(biāo)儀上采用波長(zhǎng)490 nm檢測(cè)各孔光密度值(OD)。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔，作為空白孔調(diào)零，不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液，其他實(shí)驗(yàn)步驟相同。

1.3.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST含量檢測(cè) 在缺氧/復(fù)氧實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，留取正常對(duì)照組、模型組及藥物干預(yù)組各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液3 mL，4℃貯存，留取樣本6份。樣本室溫放置 30 min后 1 000 r/min，離心 5 min，取上清液0.2 mL，按AST試劑盒操作說(shuō)明加入試劑一［100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0.26 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)溶液、3.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、3.0 kU/L 乳酸脫氫酶］2 mL，再加入試劑二［100 mmol/L Tris、240 mmol/L L- 天冬氨酸、12 mmol/L α-酮戊二酸、1.0 kU/L氫氧化鎂(MDH)2 mL］，混勻后置37℃孵育60～300 s，然后上全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST的含量。分別于60、120 s時(shí)讀取吸光度值，使用蒸餾水在340 nm處調(diào)零。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組乳鼠心肌細(xì)胞活性比較 見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型組OD值明顯降低(P＜0.05)，心肌細(xì)胞數(shù)量減少;與模型組比較，藥物干預(yù)組OD值增高(P＜0.05)，但仍較正常對(duì)照組減少(P＜0.05)。

表1 各組乳鼠心肌細(xì)胞活性比較±s

表1 各組乳鼠心肌細(xì)胞活性比較±s

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05

組 別 n OD值0.274 ±0.012模型組 8 0.189 ±0.020*藥物干預(yù)組 8 0.223 ±0.018正常對(duì)照組8＊△

2.2 各組乳鼠心肌細(xì)胞AST含量比較 見(jiàn)表2。

表2 各組乳鼠心肌細(xì)胞AST含量比較U/L，±s

表2 各組乳鼠心肌細(xì)胞AST含量比較U/L，±s

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05

組 別 n AST正常對(duì)照組1.02 ±0.45模型組 6 3.96 ±0.88*藥物干預(yù)組 6 2.55 ±0.67 6＊△

由表2可見(jiàn)，模型組AST含量較正常對(duì)照組升高(P＜0.05)，藥物干預(yù)組 AST含量較模型組降低(P＜0.05)，但仍高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。

3 討論

四妙勇安湯是一首治療脫疽的經(jīng)典古方，由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草組成，具有清熱解毒、活血止痛的功效。生脈飲是一首治療氣陰兩虛證的經(jīng)典古方，由人參、麥門(mén)冬、五味子組成，具有益氣生津、斂陰止汗功效。

MTT比色法可用于研究心肌細(xì)胞的存活力［3］，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。MTT法的原理是活細(xì)胞線(xiàn)粒體含有的琥珀酸脫氫酶能夠還原外源性的黃色MTT為不溶于水的紫藍(lán)色沉淀物，這種沉淀物被稱(chēng)之為甲瓚(Formazan)并沉積于細(xì)胞中，但是死細(xì)胞則沒(méi)有此種反應(yīng)。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，甲瓚的形成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，甲瓚形成量能夠間接反映細(xì)胞的存活力。DMSO能溶解細(xì)胞中的沉淀物甲瓚，在酶標(biāo)儀上選擇波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)這種物質(zhì)的光吸收值，從而間接地相對(duì)地反映存活狀態(tài)的心肌細(xì)胞的數(shù)量，也就能夠反映細(xì)胞的存活力。這種比色法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度相對(duì)較高，經(jīng)濟(jì)，操作比較簡(jiǎn)單，能客觀(guān)準(zhǔn)確反映細(xì)胞的生存活力與藥物作用的關(guān)系［4］;缺點(diǎn)是這種比色法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量，不能檢測(cè)細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量，而且最重要的是該實(shí)驗(yàn)方法只能檢測(cè)活細(xì)胞，對(duì)凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞不能進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物干預(yù)組心肌細(xì)胞OD值明顯高于模型組(P＜0.05)，心肌細(xì)胞活性增強(qiáng)?？赡苁撬拿钣掳矞仙}飲醇沉藥液保護(hù)了缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞的線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)或者功能，從而促使甲瓚的生成量增多，顯示該藥液具有增加缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞存活力的作用，可能起到了抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。

AST是臨床上心肌酶化驗(yàn)項(xiàng)目中的一項(xiàng)，AST在心肌細(xì)胞中的含量最多，在肝臟及骨骼肌等器官組織中也含有AST，在血清中含量極少。對(duì)于在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，檢測(cè)AST可以排除肝臟及骨骼肌對(duì)培養(yǎng)液中AST含量的影響。正常的心肌細(xì)胞幾乎不釋放AST。缺氧后心肌細(xì)胞的能量供應(yīng)從有氧氧化轉(zhuǎn)為無(wú)氧酵解，能量供應(yīng)明顯減少，細(xì)胞膜功能受損，通透性增大［5］，細(xì)胞對(duì)一定時(shí)間缺血缺氧后突然恢復(fù)的高濃度氧不能適應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)生成大量的氧自由基導(dǎo)致細(xì)胞及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，心肌細(xì)胞內(nèi)釋放大量酶［6］。本實(shí)驗(yàn)表明，與正常對(duì)照組相比，模型組、藥物干預(yù)組培養(yǎng)液中AST含量升高(P＜0.05);而與模型組相比較，加入四妙勇安湯合生脈飲醇沉藥液后的藥物干預(yù)組AST含量降低(P＜0.05)。從而可以推測(cè)，四妙勇安湯合生脈飲能夠減輕缺氧/復(fù)氧后對(duì)心肌細(xì)胞造成的損傷，有可能是通過(guò)改善細(xì)胞的有氧代謝及抑制氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷從而改善細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和功能的通透性，減少細(xì)胞釋放到培養(yǎng)液中AST含量，從而起到了對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

本研究表明，四妙勇安湯合生脈飲對(duì)缺氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，其作用可能與四妙勇安湯合生脈飲能夠提高缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞的存活力、降低缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST含量有關(guān)。

［1］劉真，魏運(yùn)湘，于慧卿，等.四妙勇安湯對(duì)缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2010，17(5):31-33.

［2］魏運(yùn)湘，劉真，于慧卿，等.四妙勇安湯加味對(duì)急性心肌梗死患者心肌保護(hù)作用的療效觀(guān)察［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8(6):664-665.

［3］關(guān)鳳英，李紅，孫巍.黃芪甲苷對(duì)新生乳鼠心肌細(xì)胞過(guò)氧化氫損傷的保護(hù)作用［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2007，33(2):211-214.

［4］余薇，查文良，吳基良，等.原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中毒性心肌炎模型的建立［J］.山東醫(yī)藥，2008，48(2):6-7.

［5］張連東，楊興易.MODS患者血清心肌酶變化及臨床意義［J］.中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2004，24(9):691.

［6］方顯明，楊建設(shè)，顧國(guó)龍，等.益心脈顆粒對(duì)家兔心肌缺血再灌注心肌損傷保護(hù)作用的研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2003，10(2):78-80.

(本文編輯:曹志娟)

Investigation of Simiao Yongan decoction with Shengmai drink on AST and cardiomyocytes activity of hy-poxic neonatal rat

MENG Yunhui，YU Huiqing，WANG Qiang，et al.Department of Cardiology，Shijiazhuang Hospital of Traditional Chinese Medicine in Hebei Province，Hebei，Shijiazhuang050051

ObjectiveTo observe the effect of Simiao Yongan decoction combined with Shengmai drink on AST and cardiomyocytes activity of hypoxic neonatal rat.MethodsSimiao Yongan decoction with Shengmai drink was decocted and made by alcohol sedimentation.The combination of trypsin and collagenase was to isolate neonatal rat myocardial cells，which were purified twice by differential adhesion method and identified by immunocytochemical Methods Primary cultured neonatal rat cardiomyocytes were randomly divided into three groups，control group，model group，and treatment group.The myocardium viability was detected by MTT colorimetric method.And AST was determined by automatic biochemical analyzer.ResultsDrug intervention can improve the OD value of each well，lower AST levels，compared with the model group，the difference was significant(P＜0.05).ConclusionThe alcohol sedimentation solution of Simiao Yongan decoction with Shengmai drink played a protective role on myocardial apoptosis，which may be relative with the improvement of the myocardium viability and the decline of the AST content in culture media induced by hypoxia/reoxygenation treatment.

Simiao Yongan decoction;Shengmai drink;Cardiomyopathy;Myocyte;Heart;Model;Animal;Animal experiment

R542.2;R285.5;R289.3

A

1002-2619(2014)08-1228-03

※項(xiàng)目來(lái)源:河北省中醫(yī)藥管理局2011年度中醫(yī)藥類(lèi)科研計(jì)劃課題(編號(hào):2011053)

孟云輝(1977—)，女，中西醫(yī)結(jié)合副主任醫(yī)師，博士。從事心血管疾病臨床研究。

2013-08-15)