程 鵬，高 萍，程 琳，李光遠(yuǎn)，祝君梅，史夢(mèng)柔，李毅敏

(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020)

實(shí)驗(yàn)研究

含銀離子燒傷敷料的遺傳毒性研究*

程 鵬，高 萍，程 琳，李光遠(yuǎn)，祝君梅，史夢(mèng)柔，李毅敏

(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020)

目的:采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌對(duì)含銀離子燒傷敷料進(jìn)行遺傳毒性研究。方法:通過鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)，觀察該敷料浸提液是否引起細(xì)胞的基因突變、染色體結(jié)構(gòu)的改變或DNA和基因的改變。結(jié)果:該試樣在3.0 cm2/ml(浸提原液劑量)樣品的二甲基亞砜(DMSO)浸提液對(duì)試驗(yàn)所用鼠傷寒沙門菌有抑制作用，3.0 cm2/ml樣品浸提液對(duì)中國(guó)倉鼠肺成纖維細(xì)胞(CHL)具有毒性作用，對(duì)體外培養(yǎng)的V79細(xì)胞無誘導(dǎo)HGPRT基因突變作用。結(jié)論:結(jié)果顯示在一定的劑量下，該含銀離子燒傷敷料未見引起明顯的遺傳毒性作用，而浸提原液劑量組具有一定的遺傳毒性作用。

遺傳毒性，銀離子，敷料

隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和人們對(duì)創(chuàng)傷愈合理論認(rèn)識(shí)的進(jìn)一步深入，人們對(duì)醫(yī)用敷料的要求逐漸提高，載銀敷料應(yīng)運(yùn)而生，其不僅能夠有效抵抗病原菌的侵染，而且對(duì)傷口愈合和皮膚再生具有顯著療效［1］。對(duì)銀離子燒傷敷料進(jìn)行臨床前安全性評(píng)價(jià)，是其應(yīng)用于臨床前的重要內(nèi)容。通過對(duì)其進(jìn)行鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)，觀察其浸提液是否引起細(xì)胞的基因突變、染色體結(jié)構(gòu)的改變或DNA和基因的改變，以降低臨床研究受試者和新產(chǎn)品上市后使用人群的使用風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法:

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品親水纖維含銀燒傷功能性敷料，是一種柔軟無菌無紡布水刺敷料，由羧甲基纖維素鈉及沿長(zhǎng)軸縫合產(chǎn)品的尼龍絲組成，含有1.2%(w/w)的銀離子。

1.1.2 試驗(yàn)菌株TA97、TA98、TA100、TA102，由天津市防病中心購入(批號(hào)20051108)，本實(shí)驗(yàn)室傳代保存，并經(jīng)鑒定合格的菌株。

1.1.3 細(xì)胞株中國(guó)倉鼠肺成纖維細(xì)胞(V79)，中國(guó)倉鼠肺成纖維細(xì)胞(CHL)，購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.4 試藥敵克松(Dexon，Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)102K0733)，2－氨基芴(2AF，Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)16F－3451)，1，8二羥基蒽醌(Fluka公司生產(chǎn)，批號(hào)447068/1)，RPMI1640培養(yǎng)液(GIBCO公司生產(chǎn)，批號(hào)1047966)，甲基磺酸乙酯(EMS)(上海試劑一廠，批號(hào)10－01－03)，7，12－二甲基苯蒽(DMBA)(Sigma，批號(hào)408181000)，秋水仙素10 μg/ml(聯(lián)星生物技術(shù)有限公司，進(jìn)口分裝)，絲裂霉素(MC，浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)100110)，環(huán)磷酰胺(CP，江蘇恒瑞藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)10110621)，代謝活化系統(tǒng):S9混合液(本實(shí)驗(yàn)室制備)。

1.2 材料的準(zhǔn)備Ames試驗(yàn)將樣品以3 cm2/ml+吸收量的比例置生理鹽水(NS)和二甲基亞砜(DMSO)中，50℃下浸提72 h作為浸提原液;體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)將樣品以同樣比例置含10%胎牛血清培養(yǎng)液中，37℃下浸提72 h;哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外基因突變?cè)囼?yàn)將樣品以同樣比例置無血清培養(yǎng)液中，37℃下浸提72 h。

1.3 Ames試驗(yàn)菌株:鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102。陰性對(duì)照:同批號(hào)浸提介質(zhì)。陽性對(duì)照:敵克松(500 μg/ml)、2－氨基芴(2 mg/ml)、1，8－二羥基蒽醌(500 μg/ml)。檢驗(yàn)方法:平板摻入法。試驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、浸提原液組、1/2浸提原液組、1/4浸提原液組。非活化試驗(yàn);加入0.2 mol/L磷酸緩沖液0.5 ml及受試液、新鮮菌液各0.1 ml。活化試驗(yàn)，加入5%S9mix 0.5 ml及受試液、新鮮菌液各0.1 ml。置37℃培養(yǎng)72 h后統(tǒng)計(jì)回變菌落數(shù)。同時(shí)做S9mix檢菌。

1.4 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)采用同批浸提介質(zhì)作為空白對(duì)照。含0.25 μg/ml絲裂霉素的同批浸提介質(zhì)作為非活化系統(tǒng)的陽性對(duì)照。含20 μg/ml環(huán)磷酰胺的同批浸提介質(zhì)作為活化系統(tǒng)的陽性對(duì)照。

試驗(yàn)所用細(xì)胞株為中國(guó)倉鼠肺成纖維細(xì)胞(CHL)。將生長(zhǎng)旺盛的CHL細(xì)胞用胰蛋白酶液消化，制備成5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，每個(gè)培養(yǎng)皿接種3.0 ml。24 h后吸去培養(yǎng)液，加入試驗(yàn)樣品浸提液，共設(shè)三個(gè)劑量組(浸提原液組、1/2浸提原液組、1/4浸提原液組)、空白對(duì)照組和陽性對(duì)照組。非活化系統(tǒng)分別培養(yǎng)24 h和48 h，收獲細(xì)胞。活化系統(tǒng)(加S9混合液)在2.7 ml試驗(yàn)樣品浸提液中加入0.3 ml S9混合液，6 h后將液體吸去，用Hanks液洗細(xì)胞3次，加入含血清1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，收獲細(xì)胞。收獲前3 h加入秋水仙素，阻斷細(xì)胞有絲分裂的中期分裂相。每一試驗(yàn)組選擇100個(gè)分散良好的中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行染色體畸變分析，計(jì)算畸變率，采用χ2檢驗(yàn)對(duì)各組畸變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外基因突變?cè)囼?yàn)陰性對(duì)照為無血清培養(yǎng)液;陽性對(duì)照非活化系統(tǒng)為1.0 mg/ml甲基磺酸乙酯溶液(EMS)，活化系統(tǒng)為250 μg/ml 7，12－二甲基苯蒽(DMBA)。

取純化V79細(xì)胞，每個(gè)50 ml大小的培養(yǎng)瓶接種5.0×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)20 h后，非活化系統(tǒng)分別加入5.0 ml材料浸提液及對(duì)照液;活化系統(tǒng)分別加入4.5 ml材料浸提液及對(duì)照液后，再加入0.5 ml S9混合液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。棄去含受試物的培養(yǎng)液，D－Hank’s液洗滌，換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)20 h。上述細(xì)胞經(jīng)消化液消化、計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種2.0×102個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)7 d后用甲醇固定，姬姆薩染色，計(jì)數(shù)形成的集落。另外在50 ml的培養(yǎng)瓶中接種5.0×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。中間低密度傳代一次。表達(dá)結(jié)束后，消化計(jì)數(shù)，6孔板的每孔中接種2.0×102個(gè)細(xì)胞，7 d后測(cè)定細(xì)胞克隆形成率。同時(shí)在6孔板的孔中接種1.5×105個(gè)細(xì)胞，2 h后加入含6－TG選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，作HGPRT基因突變集落選擇，選擇期為10 d，計(jì)算基因位點(diǎn)突變頻率。

2 結(jié)果

2.1 Ames試驗(yàn)①在活化和非活化條件下，3.0 cm2/ml樣品的生理鹽水浸提液對(duì)試驗(yàn)所用鼠傷寒沙門菌無誘變性。②在活化下，3.0 cm2/ml樣品的DMSO浸提液對(duì)試驗(yàn)所用鼠傷寒沙門菌無誘變性。③在非活化下，3.0 cm2/ml(浸提原液劑量)樣品的DMSO浸提液對(duì)試驗(yàn)所用鼠傷寒沙門菌有抑制作用。在下列試驗(yàn)劑量下對(duì)以下試驗(yàn)菌株無誘變性:TA97:1/16，1/32和1/64劑量;TA98:1/2、1/4和1/8劑量;TA100: 1/16、1/32和1/64劑量;TA102:1/8、1/16和1/32劑量。見表1。

表1 鼠傷寒沙門菌回復(fù)_突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)3.0cm2/ml樣品浸提液對(duì)CHL細(xì)胞具有毒性作用，半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(IC50)為0.44 cm2/ml。在活化和非活化條件下，0.44、0.22和0.11 cm2/ml樣品浸提液與CHL細(xì)胞接觸后，染色體畸變率均為0%，與空白對(duì)照組比較無顯著差異(P＞0.05)。上述劑量的試驗(yàn)樣品浸提液對(duì)培養(yǎng)的CHL細(xì)胞無誘發(fā)染色體畸變作用，見表2和表3。

表2 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)細(xì)胞毒性測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

表3 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外基因突變?cè)囼?yàn)在活化和非活化條件下，3.0、1.5和0.75 cm2/ml樣品浸提液對(duì)體外培養(yǎng)的V79細(xì)胞無誘導(dǎo)HGPRT基因突變作用，見表4。

表4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外基因突變?cè)囼?yàn)的克隆形成率和突變頻率

3 討論

目前可持續(xù)釋放銀離子的含銀醫(yī)用敷料已成功地應(yīng)用于傷口護(hù)理中［2］，在臨床上使用并取得很好的效果。但是該類產(chǎn)品大多是與人體直接接觸，所以必須考慮其細(xì)胞的遺傳毒性，且其生物安全性均需在上市前進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本項(xiàng)研究依據(jù)毒理學(xué)研究原則設(shè)計(jì)的三項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)［3，4］，其結(jié)果可最大限度地覆蓋該銀離子敷料的遺傳毒性作用。由結(jié)果可看出，該材料在一定的劑量下未引起細(xì)胞的基因突變、染色體結(jié)構(gòu)的改變或DNA和基因的改變。而其浸提原液的劑量下，對(duì)Ames試驗(yàn)和體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)中，有明顯的抑菌作用和細(xì)胞毒性?？赡苡捎阢y粒子比較容易透過細(xì)胞膜上的孔隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或進(jìn)入包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、高爾基體和細(xì)胞核等細(xì)胞器內(nèi)，并且和生物大分子發(fā)生結(jié)合或催化化學(xué)反應(yīng)，使生物大分子和生物膜的正常立體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞毒性［5］。由于該項(xiàng)研究中對(duì)材料的浸提液濃度進(jìn)行了稀釋，其遺傳毒性是否與稀釋劑量有依賴性關(guān)系還需進(jìn)一步研究。目前，銀離子敷料的生物安全性如何及其組成成分羧甲基纖維素鈉及尼龍絲是否影響銀離子的釋放量尚無定論，也是該材料在臨床使用中亟待解決的問題。

1焦展，安勝軍，溫昕，等.載銀敷料研究現(xiàn)狀與展望［J］.中華創(chuàng)傷雜志，2009，25(10):958－960

2秦益民.銀離子的釋放及敷料的抗菌性能［J］.紡織學(xué)報(bào)，2007，28 (1):120－123

3GB/T 16886.3－2008.醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第3部分:遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)［S］.

4袁伯俊，王治喬.新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)與實(shí)踐［M］.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院出版社，1997:78－88

5黃清泉，王蓉蓉，王春仁，等.納米銀醫(yī)療產(chǎn)品的體外細(xì)胞毒性比［J］.藥物分析雜志，2009，29(12):2150－2153

The genotoxic study of silver ions dressing

Cheng Peng，Gao Ping，Cheng Lin，Li Guangyuan，Zhu Junmei，Shi Mengrou，Li Yimin
(Tianjin Institute of Medical and Pharmacoutical Sciences，Tianjin 300020)

Objective:to study genotoxic of silver ions dressing by using mammal cell and bacterial.Method:to observe if it can cause gene mutations，changes in chromosome structure，or other dna and gene changing by amas test，in vitro mammalian chromosome aberration test and in vitro mammalian cell gene mutation test.Result:the concentration of 3.0 cm2/ml cause inhibition in Salmonella typhimurium，and toxic action in chl.but wouldn’t cause gene mutations in V79.Conclusion:in certain dose silver ions dressing can’t cause genotoxic，but at the concentration of 3.0 cm2/ml，it can cause genotoxic.

genotoxic，silver ions，dressing

R969.3

A

1006－5687(2014)02－0001－03

2013－10－15