張 茉，周 軍，李文艷

(1.天津市藥品檢驗(yàn)所，天津300070;2.天津隆順榕發(fā)展制藥有限公司，天津300232)

香連化滯片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究*

張 茉1，周 軍1，李文艷2

(1.天津市藥品檢驗(yàn)所，天津300070;2.天津隆順榕發(fā)展制藥有限公司，天津300232)

目的:完善香連化滯片的質(zhì)量控制方法。方法:采用薄層色譜方法鑒別香連化滯片中的陳皮、黃連;采用高液相色譜法測(cè)定其中芍藥苷和黃芩苷的含量。芍藥苷含量測(cè)定色譜條件:采用Agilent ZORBAX SB－C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以70%乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm;黃芩含量測(cè)定色譜條件:采用phenomenex luna－C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇－水－磷酸(47∶53∶0.1)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm。結(jié)果:在選定的薄層色譜條件下，層析斑點(diǎn)清楚，分離效果較好;HPLC方法學(xué)考查顯示芍藥苷在0.011 73～2.932 0 μg范圍內(nèi)線性良好(r=0.999 9)，平均加樣回收率為99.06%(n=6)，RSD為0.71%;黃芩苷在0.022 316～5.579 0 μg范圍內(nèi)線性良好(r=0.999 9)，平均加樣回收率為98.82%(n=6)，RSD為0.70%。結(jié)論:該方法快捷、準(zhǔn)確，可作為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

香連化滯片，薄層色譜法，高效液相色譜法，芍藥苷，黃芩苷

香連化滯片由白芍、當(dāng)歸、黃芩、陳皮、黃連等12味中藥組成，具有調(diào)中化滯，止痛止痢的功效，用于紅白痢疾，里急后重，肚腹絞痛，停滯不消。其原標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部《藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十五冊(cè)》，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為WS3－B－2937－98。在2010—2011年度國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高工作中，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了提高和完善。在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，增加了陳皮的薄層鑒別方法，修訂了黃連的薄層鑒別;增加了芍藥苷和黃芩苷的含量測(cè)定方法。修訂后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高了藥品的質(zhì)量控制指標(biāo)，可更好的控制香連化滯片的產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

SHIMADZU LC－20AD高效液相色譜儀，LC－So-lution工作站。黃連對(duì)照藥材(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)913－9905)，陳皮對(duì)照藥材(中國(guó)藥品生物制品檢定所，120969－200808)，芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110736－201136，供含量測(cè)定用，純度96.0%)，黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110715－201117，供含量測(cè)定用，純度91.7%)。香連化滯片樣品為國(guó)內(nèi)某企業(yè)生產(chǎn)(批號(hào)為110406、110508、110509、110717)。乙腈、甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 陳皮的薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備取樣品粉末2 g，加甲醇40 ml，超聲處理40 min，濾過(guò)，取濾液1 ml備用，剩余濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 ml使溶解，加乙酸乙酯提取2次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，加水洗滌2次，每次20 ml，棄去水液，乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備取陳皮對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇10 ml，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備按處方配比，取處方藥材2 g(因處方中陳皮、青皮、枳實(shí)同時(shí)含橙皮苷等黃酮類成分，因此采用缺陳皮、青皮、枳實(shí)陰性對(duì)照)，按照供試品項(xiàng)下的方法提取，以缺陳皮、青皮、枳實(shí)的樣品溶液為陰性樣品溶液1，以缺青皮、枳實(shí)的樣品溶液為陰性樣品溶液2。

2.1.4 薄層色譜條件及結(jié)果照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各2～4 μl，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯(1∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 黃連的薄層色譜

2.2.1 供試品溶液的制備取“2.1.1”項(xiàng)下備用的甲醇提取液作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照藥材溶液的制備取黃連對(duì)照藥材0.25 g，加甲醇25 ml，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照藥材溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備按處方配比，取處方藥材2 g(黃連除外)，按照供試品項(xiàng)下的方法提取，作為陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 薄層條件及結(jié)果照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各1～2 μl，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯－異丙醇－甲醇－水－三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開(kāi)劑，置用濃氨試液飽和10 min的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈下(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖1 陳皮薄層色譜圖

圖2 黃連薄層色譜圖

表1 芍藥苷梯度洗脫系統(tǒng)

2.3 芍藥苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件Agilent ZORBAX SB－C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;以70%乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;柱溫30℃;流速1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm;理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 對(duì)照品溶液的制備取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 ml中含22 μg的溶液，即得。

2.3.2.2 供試品溶液的制備取樣品(批號(hào)110508)適量，研細(xì)，取0.2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 ml，稱定重量，置水浴上加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心5 min (3 000 r/min)，取上清液，濾過(guò)(0.45 μm微孔濾膜)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備按處方取除白芍的各味藥材，按制法制得樣品，再按“2.3.2.2”供試品溶液的制備方法，制得白芍陰性對(duì)照溶液。

2.3.3 陰性對(duì)照試驗(yàn)精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μl，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品中所含其他藥材和輔料，均不干擾芍藥苷的測(cè)定。見(jiàn)圖3。

圖3 對(duì)照品(A)供試品(B)陰性樣品(C)HPLC色譜圖

2.3.4 線性關(guān)系考查取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為每1 ml中含芍藥苷分別為1.173 0、5.865 0、11.730 0、29.320 0、146.600 0和293.200 0 μg的對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別測(cè)定各自峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程: Y=－4 048.91+1 477 587.37 X(r=0.999 9，n=6)。結(jié)果表明，芍藥苷在0.011 73～2.932 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)(110508)樣品適量，研細(xì)，取0.2 g，精密稱定，共取6份，精密加入70%甲醇25 ml，按“2.3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，依“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，樣品中芍藥苷含量平均值為2.781 0 mg/g，RSD為1.15%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6 精密度試驗(yàn)取同一批號(hào)(110508)樣品適量，研細(xì)，取0.2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定芍藥苷峰面積，樣品中芍藥苷峰面積平均值為341 654，RSD為0.95%(n=6)。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批號(hào)(110508)樣品適量，研細(xì)，取0.2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”供試品溶液制備方法操作，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別在0、2、4、8、12、18和24 h進(jìn)樣測(cè)定1次，測(cè)得樣品中芍藥苷峰面積平均值為339 708，RSD為1.16%(n=7)。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 回收率試驗(yàn)取同一批號(hào)(110508)樣品適量，研細(xì)，取0.1 g，精密稱定，共6份，分別精密加入濃度為0.011 727 mg/ml的芍藥苷對(duì)照品70%甲醇溶液25 ml，按照“2.3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析。結(jié)果芍藥苷平均加樣回收率為99.06%，RSD為0.71%(n=6)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)(n=6)

2.3.9 樣品測(cè)定取同一廠家4個(gè)不同批號(hào)的樣品，按照“2.3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定樣品中芍藥苷含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 黃芩苷含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件phenomenex Luna C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)色譜柱;以甲醇－水－磷酸(47∶53∶0.1)為流動(dòng)相;柱溫30℃;流速1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

表3 芍藥苷樣品含量測(cè)定

2.4.2 溶液的制備

2.4.2.1 對(duì)照品溶液的制備取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml中含黃芩苷24 μg的溶液，即得。

2.4.2.2 供試品溶液的制備取“2.3.2.2”項(xiàng)下的供試品溶液，即得。

2.4.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備按處方取除黃芩的各味藥材，按制法制得樣品，再按“2.3.2.2”供試品溶液制備方法，制得黃芩陰性樣品溶液。

2.4.3 陰性對(duì)照試驗(yàn)精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μl，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品中所含其他藥材和輔料均不干擾黃芩苷的測(cè)定。見(jiàn)圖4。

2.4.4 線性關(guān)系考查取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為每1 ml中含黃芩苷分別為2.231 6、11.158 0、22.316 0、55.790 0、278.950 0和557.900 0 μg的對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別測(cè)定各自峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程:Y= 11 818.28+3 980 910.54 X(r=0.999 9，n=6)。結(jié)果表明，黃芩苷在0.022 316～5.579 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)(110508)樣品適量，研細(xì)，取0.2 g，精密稱定，共取6份，分別精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”供試品溶液制備操作，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分析，樣品中黃芩苷含量平均值為5.605 5 mg/g，RSD為0.45%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.6 精密度試驗(yàn)取同一批號(hào)(110508)樣品適量，研細(xì)，取0.2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定黃芩苷峰面積，樣品中黃芩苷峰面積平均值為895 498，RSD為1.11%(n=6)。

圖4 對(duì)照品(A)供試品(B)陰性樣品(C)HPLC色譜圖

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批號(hào)(110508)樣品適量，研細(xì)，取0.2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、18和24 h進(jìn)樣，測(cè)定，樣品中黃芩苷峰面積平均值為903 570，RSD為0.60% (n=7)。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 回收率試驗(yàn)取同一批號(hào)(110508)樣品適量，研細(xì)，取0.1 g，精密稱定，共6份，分別精密加入濃度為0.022 316 mg/ml的黃芩苷對(duì)照品70%甲醇溶液25 ml，按照“2.3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分析。結(jié)果黃芩苷平均加樣回收率為98.82%，RSD為0.70%(n=6)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 黃芩苷回收率試驗(yàn)

2.4.9 樣品測(cè)定取同一廠家4個(gè)不同批號(hào)的樣品，按照“2.3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定樣品中黃芩苷含量。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 黃芩苷樣品含量測(cè)定

3 討論

3.1 陳皮揮發(fā)油鑒別方法的探索

3.1.1 供試品溶液的制備取樣品粉末5 g，加石油醚(30～60℃)30 ml，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液低溫蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? ml使溶解，作為供試品溶液。

3.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備取陳皮對(duì)照藥材0.5 g，按“3.1.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。

3.1.3 陰性樣品溶液的制備按處方配比，取處方藥材5 g(陳皮除外)，按照供試品項(xiàng)下的方法提取，作為陰性對(duì)照溶液。

3.1.4 薄層條件及結(jié)果照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各2～6 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，分別以石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(20∶1)、石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(9∶1)、石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，均噴以5%香草醛硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。結(jié)果供試品色譜中在與陳皮對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上未見(jiàn)同顏色的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖5。這可能是由于揮發(fā)性成分在樣品儲(chǔ)藏過(guò)程中易損失，故此鑒別方法未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，以鹽酸小檗堿對(duì)照品鑒別制劑中的黃連，專屬性不強(qiáng)，不能排除樣品中直接添加鹽酸小檗堿的可能性。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，改用黃連對(duì)照藥材控制中的黃連，更具有專屬性。故將此項(xiàng)鑒別改為以黃連藥材為對(duì)照，作為樣品中黃連的控制手段更為合理。

圖5 陳皮揮發(fā)油薄層色譜圖

3.3 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，芍藥苷和黃芩苷的含量測(cè)定試驗(yàn)共用一份樣品溶液，既節(jié)省了樣品的取樣量，又節(jié)省了試劑和提取操作時(shí)間，環(huán)保經(jīng)濟(jì)。

R927.11

A

1006－5687(2014)01－0010－05

2013-08-16