郭會(huì)玲，易 忠，艾尼瓦爾·臺(tái)外庫(kù)力，陶興洋，斯馬依·伊斯拉木，達(dá)力夏·孜乃提，包拉提，王 延，薛 英，魏玉榮*,黃 炯*

（1.新疆新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆喀什地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆 喀什 844000；3.新疆克拉瑪依綠成農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，新疆 克拉瑪依 834000；4.新疆塔什庫(kù)爾干縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 塔什庫(kù)爾干 845250；5.新疆塔什庫(kù)爾干縣達(dá)布達(dá)爾鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，新疆 塔什庫(kù)爾干 845250；6.新疆昭蘇縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 昭蘇 835600）

泰勒焦蟲(chóng)表面抗原TaSP、spag-1和Tams1基因片段克隆與序列分析

郭會(huì)玲1，易 忠1，艾尼瓦爾·臺(tái)外庫(kù)力2，陶興洋3，斯馬依·伊斯拉木4，達(dá)力夏·孜乃提5，包拉提6，王 延1，薛 英1，魏玉榮1*,黃 炯1*

（1.新疆新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆喀什地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆 喀什 844000；3.新疆克拉瑪依綠成農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，新疆 克拉瑪依 834000；4.新疆塔什庫(kù)爾干縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 塔什庫(kù)爾干 845250；5.新疆塔什庫(kù)爾干縣達(dá)布達(dá)爾鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，新疆 塔什庫(kù)爾干 845250；6.新疆昭蘇縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 昭蘇 835600）

為了解泰勒焦蟲(chóng)表面抗原基因特性，利用PCR方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的泰勒焦蟲(chóng)細(xì)胞表面抗原spag-1、Tams1和TaS部分基因片段進(jìn)行克隆與序列分析。PCR結(jié)果顯示所擴(kuò)增的spag-1、Tams1和TaSP部分基因長(zhǎng)度分別為372bp，324bp和321bp。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，與本次測(cè)序表面抗原TaSP和Tams1基因片段同源性最高的蟲(chóng)株登錄號(hào)分別為FJ895154和AF214797的泰勒焦蟲(chóng)株，同源性分別高達(dá)100%與99.69%；與spag-1基因片段同源性最高的蟲(chóng)株登錄號(hào)為X78188、XM949884和M63017，它們之間同源性為100%。

泰勒焦蟲(chóng)；TaSP；spag-1；Tams1；克?。恍蛄蟹治?/p>

泰勒焦蟲(chóng)病是蜱傳性血液原蟲(chóng)病。泰勒焦蟲(chóng)（Thei1eria annu1ata，T.annu1ata）表面抗原有子孢子表面抗原 （The sporozoite antigen，spag-1）、裂殖子/梨漿蟲(chóng)表面抗原 （The merozoite/pirop1asm surface antigen, Tams1）和裂殖體表面抗原（Thei1eria annu1ata surface protein，TaSP）等。Spag-1是病原入侵和被宿主細(xì)胞識(shí)別所必須的，可溶性的spag-1作為ELISA抗原檢測(cè)T.annu1ata感染抗體非常有效[1]。Tams1是蟲(chóng)體感染紅細(xì)胞時(shí)表面分泌的一種膜蛋白，具有較好的免疫原性，同樣存在抗原多樣性[2]。TaSP是一種免疫分子，感染宿主可以通過(guò)主要組織相容復(fù)合物(major histocompatibi1ity comp1ex，MHC)的遞呈產(chǎn)生抗TaSP的抗體[3]。TaSP、spag-1和Tams1在焦蟲(chóng)--機(jī)體免疫中起到重要作用，其蛋白內(nèi)部的高免疫原性區(qū)有可能成為研制亞單位疫苗的重要靶點(diǎn)。了解泰勒焦蟲(chóng)表面抗原SPAG1、Tams1和TaSP基因特性可為其亞單位疫苗或診斷試劑的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品及主要試劑

DH5a宿主菌由本室保存，pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，P1asmid Minipreps Kit、Wizard Genomic DNA Purification Kit、Ge1 Extraction Kit均購(gòu)自Promega公司。

1.2 焦蟲(chóng)基因組提取

懸浮培養(yǎng)泰勒焦蟲(chóng)細(xì)胞液3 mL，12 500 r/min離心30 s，加入300 μL PBS懸浮。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit，參照試劑說(shuō)明提取焦蟲(chóng)基因組，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank登錄的泰勒焦蟲(chóng)spag-1、Tams1、TaSP及全基因組序列，應(yīng)用軟件O1igo6.24進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由北京捷瑞生物公司合成（表1）。以焦蟲(chóng)基因組為模板進(jìn)行PCR。

表1 擴(kuò)增Tams1、SPAG1、TaSP基因的引物

Tams1、spag-1及TaSP基因部分片段的擴(kuò)增：以提取的焦蟲(chóng)基因組為模板，分別以Tams1 F/R、SPAG1 F/R及TaSP F/R為引物通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因Tams1、spag-1及TaSP。反應(yīng)體系如0.2 mL PCR管中加入：10×Pfu DNA po1ymerase緩沖液5 μL，10 mM dNTP 2 μL，MgC12（2.5 mM）2 μL，上下游引物(20 pmo1)各1 μL，Pfu DNA po1ymerase(5U)0.5 μL，加入ddH2O使反應(yīng)總體積至50 μL。反應(yīng)參數(shù)為：94℃5 min；94℃45 s，50℃35 min，72℃45 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃保溫10 min。 PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取產(chǎn)物8 μL經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定正確的目的條帶切膠回收，分別命名為基因Tams1、spag-1和TaSP。

1.4 PCR產(chǎn)物的克隆及序列測(cè)定

PCR產(chǎn)物回收與提取質(zhì)粒酶切鑒定、篩選陽(yáng)性克隆、pMD18-T載體連接，均按試劑盒說(shuō)明操作。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a。挑取經(jīng)鑒定含相應(yīng)基因片段的各克隆送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的克隆分別命名為pMD-TaSP、pMD-spag-1和pMD-Tams1。

TaSP、spag-1和Tams1基因的序列分析 運(yùn)用DNAMAN及DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，并與Genbank中相關(guān)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，運(yùn)用MEGA5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 泰勒焦蟲(chóng)表面抗原TaSP、spag-1及Tams1基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別使用TaSP、spag-1和Tams1基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示TaSP、spag-1 和Tams1基因片段擴(kuò)增大小分別是372bp，324bp，321bp，與預(yù)期條帶大小一致（見(jiàn)圖1）。

圖1 TaSP、spag-1及Tams1基因片段PCR產(chǎn)物

2.2 TaSP、spag-1及Tams1基因片段序列測(cè)定結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立

經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序后，所得TaSP、spag-1和Tams1片段序列（）與Genbank中相關(guān)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，運(yùn)用MEGA5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖2、3、4）。

TaSP基因片段：gaagatcaacagcctttggaccctaatcaacttataga tcaagctgaacaatctcaagaacctatt caacctactgatgaatctccacagg aacaggaacagatagaaactcaagaatctgaagagttagagccagaaactgttacagtagaagttccagaacccgttacatcagaagaatctaaggaatctactcaa actgaacaaaaaccagaacaacctgaaccagttgatgaacctccagttcaacctactgaatctactcctactaaggcaagttctagtggtgatggagcagcccctt gtcatgggaaacaccatgatgatgactctgacgggaaagaatctaaatcc

spag-1基因片段：gaagttttgaaagttctggatgaactagtgaaggatgtaagcgaagaacatgttggaatagg agatt taagtgacccaagtagcagaac accaaatgcaaaaccagccgaact tggaccttcactagtgatacaaaatgta ccgtcagacccctcaaaagtgacaccaacacagccttcaaatttgccacaag taccaacaacagggccggggaacggg acggatggaacaacaacaggaccaggtggaaacggggaaggaggcaaagatttgaaggaaggagaaaagaaagaa ggattatttcaaaagatcaaaaacaaactc

TamsI基因片段：ttcaaaccttccaaagttctcttcgaaaagaaagaagtcggaaaaccaaacaatgccaagta tcttgatgttttcgtctttgtcagtgctgat tccaagaaggtcgtcagactcgactacttctataccggtgactcaaggttaaaggagacctacttcgagcttaaggacgataagtgggttcaaatgtcacaggcagatg caaacaaggccttgaacgccatggactcatcatggtcatccgattacaaaccagttgtcgacaagttctctccccttgcagtcttcgcctcagtactcatcgtcttctc atcagtcctt

將測(cè)序獲得的基因序列 （以Thei1eria annu1ata XJ標(biāo)注）與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中其他泰勒焦蟲(chóng)進(jìn)行比較。比對(duì)所用序列的登錄號(hào)見(jiàn)表2。

表2 本文所用到的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的泰勒焦蟲(chóng)序列

從圖2可見(jiàn)本次測(cè)序獲得Tasp基因序列與Genbank登錄號(hào)為FJ895154的泰勒焦蟲(chóng)株在同一進(jìn)化分支，且序列同源性最高達(dá)100%，由此可以推測(cè)二者來(lái)源相同或?qū)儆谕幌x(chóng)株。從進(jìn)化樹(shù)可見(jiàn)，本文比對(duì)的8條序列明顯聚類(lèi)為兩大分支：中國(guó)新疆泰勒焦蟲(chóng)蟲(chóng)株與蘇丹蟲(chóng)株（登錄號(hào)為EU032559、EU032559），它們的親緣關(guān)系更近，同源性達(dá)90%；中國(guó)寧夏、內(nèi)蒙古及中國(guó)某地蟲(chóng)株處在另一進(jìn)化分支，同源性為95.5%，該進(jìn)化分支與本次測(cè)序序列同源性約為85%。

圖2 基于Tasp基因的進(jìn)化樹(shù)分析

從圖3可見(jiàn)，基于Tams1基因與Genbank其它泰勒焦蟲(chóng)做遺傳進(jìn)化分析也具有明顯的兩大進(jìn)化分支。本次測(cè)序獲得Tams1基因與來(lái)自印度（登錄號(hào)AF21 4840）和蘇丹（登錄號(hào)AF214797）的蟲(chóng)株親緣關(guān)系最近，同源性分別為99.38%和99.69%。中國(guó)甘肅株與突尼斯蟲(chóng)株親緣關(guān)系較近，它們之間的同源性高達(dá)98.34%。測(cè)序的新疆株與甘肅株間的同源性為96.57%。

圖3 基于Tams1基因的進(jìn)化樹(shù)分析

從圖4可以看出，基于spag-1基因所建立的進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)為兩大分支。本次測(cè)序獲得spag-1基因序列與土耳其（登錄號(hào)X78188、XM949884）及印度（登錄號(hào)M63017）蟲(chóng)株親緣關(guān)系最近，它們之間同源性為100%，可見(jiàn)其來(lái)源相同或?qū)儆谕幌x(chóng)株。本次測(cè)序基因spag-1與蘇丹蟲(chóng)株序列（登錄號(hào)AF128526）同源性為77.78%，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 基于spag-1基因的進(jìn)化樹(shù)分析

3 討 論

近年來(lái)，T.annu1ata流行區(qū)域在逐漸擴(kuò)大。簡(jiǎn)子健等人利用間接ELISA血清學(xué)診斷方法，對(duì)2006-2008年期間新疆14地州市監(jiān)測(cè)點(diǎn)牛群進(jìn)行T.annu1ata流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)新疆T.annu1ata感染的特點(diǎn)是疫區(qū)分布廣，感染率在11%以上，且有上升趨勢(shì)[4]。巴音查汗等人的調(diào)查表明新疆牛泰勒焦蟲(chóng)病發(fā)病率和死亡率可達(dá)40%或更高[5]。鑒于T.annu1ata對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害，筆者從分子生物學(xué)方面對(duì)T.annu1ata基因組片段進(jìn)行了擴(kuò)增并進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析。

本試驗(yàn)對(duì)所保存的新疆泰勒焦蟲(chóng)株表面抗原TaSP、spag-1和Tams1基因片段進(jìn)行了克隆，并對(duì)序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明：擴(kuò)增的新疆株泰勒焦蟲(chóng)TaS基因序列與登錄號(hào)FJ895154中國(guó)新疆株親緣關(guān)系最近達(dá)100%，可能為同一起源或同一蟲(chóng)株，同時(shí)該蟲(chóng)株與蘇丹（登錄號(hào)為EU032559、EU032559）蟲(chóng)株同源性也很高；Tams1基因序列與蘇丹（登錄號(hào)AF214797）及印度（登錄號(hào)AF214840）蟲(chóng)株同源性高達(dá)99%以上；spag-1基因序列與土耳其 （登錄號(hào)X78188、XM949884）及印度 （登錄號(hào)M63017）蟲(chóng)株同源性高達(dá)100%，但與蘇丹（登錄號(hào)AF128526）同源性較低。由于寄生蟲(chóng)基因組龐大，Genbank中泰勒焦蟲(chóng)全基因組序列信息非常有限，本次只是表面抗原基因片段測(cè)序，還不能推測(cè)所測(cè)序蟲(chóng)株的準(zhǔn)確起源。

綜上所述，本次對(duì)泰勒焦蟲(chóng)表面抗原SPAG1、Tams1和TaSP基因片段進(jìn)行克隆及測(cè)序，旨在了解測(cè)序蟲(chóng)株的基因特性，為其亞單位疫苗或診斷試劑的制備奠定基礎(chǔ)。

[1]katzer F.,Carrington M.,Knight P.,et a1.Po1ymorphism of SPAG-1,a candidate antigen for inc1usion in a subunit vaccine against Thei1eria annu1ata[J].Mo1 Biochem parasito1,1994,（67）:1-10．

[2]Knighta,P.,Musokeb,A.J.,Gachanjab,J.N.,et a1.Conservation of neutra1izing determinants between thesporozoite surface Antigens of Thei1eria annu1ata and Thei1eria parva[J].Exp Parasito1,1996,82(3):229-241.

[3]Seitzer,U.,Bakheit,M..A.,Sa1ih,D.A.,et a1.From mo1ecu1e to diagnostic too1:Thei1eria annu1ata surface proteinTaSP[J].Parasito1 Res,2007,101(Supp1 2):S217-S223.

[4]簡(jiǎn)子健,馬素貞,孫其喆,等.新疆牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,48(8):1509-1513.

[5]曹雯麗,陳亮,劉啟生,巴音查汗.新疆牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)病的流行現(xiàn)狀和防治[J].草食家畜，2011,152(3):76-78.

Cloning and Sequence Analysis of TaSP,Spag-1 and Tams1 Gene Fragments of Theileria Annulata Surface Antigen

GUO Hui-1ing1,YI Zhong1,AINIWAERO·Taiwaiku1i2,TAO Xing-yang3，SIMAYIO·Yisi1amu4, DALIXIAO·Zimaiti5,BAO La-ti6,WANG Yan1,XUE Yin1,WEI Yu-rong1*,HUANG Jiong1*
（1.Institute of Veterinary Medicine,Xinjiang Academy ofAnima1 Sciences,Urumqi 830000,China；2.Contro1 and Diagnosis Center of the Anima1 Disease from Kashgar Region,Kashgar 844000,China；3.Ka1amayi Lucheng Agricu1tura1 Exp1oiture Co,.LTD,Ka1amayi 8340000，China；4.Tashkurgan Anima1 Husbandry and Veterinary Station in Xinjiang,Tashkurgan Xinjiang 845250，China; 5.Dabudar country Anima1 Husbandry and Veterinary Station in Tashkurgan, Tashkurgan Xinjiang 845250，China; 6.Zhaosu Anima1 Husbandry and Veterinary Station in Yi1i Region,Zhaosu Xinjiang 835600,China）

To study the genes characteristics of Thei1eria annu1ata surface antigen,gene fragments of spag-1 and Tams1 and Tasp were c1oned by PCR and sequenced.The resu1t showed that PCR products of genes fragment of TaSP,spag-1 and Tams1 were 372bp,324bp and 321bp,respective1y.After sequenced,phy1ogenetic tree was drew using genes fragment TaSP,Tams1 and spag-1.The ana1ysis of Phy1ogenetic tree revea1ed that he highest homo1ogy is 100%with the stain of accession number FJ895154 based on Tasp gene sequences of Thei1eria annu1ata,and it has a high homo1ogy with the stain of accession number AF214797 of 99.69%based on Tasp gene sequences of Thei1eria annu1ata.The sequence of spag-1 genes fragment is most simi1ar to the stain of accession number X78188,XM949884 and M63017 with 100%,respective1y.

thei1eria annu1ata；TaSP；spag-1；Tams1；c1one；sequence ana1ysis

S855.9

：A

：1003－6377（2014）02－0055-05

2014-01-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160505）,十二五"國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2013BAD2B04）

郭會(huì)玲（1973-），女，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病研究。

魏玉榮（1978-），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事動(dòng)物傳染病研究。

黃炯（1963-），男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物傳染病研究與生物制品研發(fā)。