何玉仙，康廣平，魯立柱，黃 炯

（1.新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830032 2.新疆畜牧科學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000）

山羊痘活疫苗病毒含量測(cè)定與用羊效力檢驗(yàn)相關(guān)一致性改進(jìn)對(duì)比試驗(yàn)

何玉仙1，康廣平1，魯立柱1，黃 炯2

（1.新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830032 2.新疆畜牧科學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000）

近兩年本公司山羊痘活疫苗成品分別采用病毒含量測(cè)定和效力檢驗(yàn)，病毒含量測(cè)定達(dá)到《獸用生物制品制造與檢驗(yàn)規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)，效力檢驗(yàn)出現(xiàn)痘型小、不明顯，持續(xù)時(shí)間短，與《獸用生物制品制造與檢驗(yàn)規(guī)程》中規(guī)定有差異。針對(duì)此現(xiàn)象,本公司通過(guò)增加種毒羊睪丸細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液、提高單位體積內(nèi)病毒含量培養(yǎng)、收獲毒液，達(dá)到病毒含量測(cè)定達(dá)標(biāo)且效力檢驗(yàn)中痘型大、明顯、且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，與規(guī)程表現(xiàn)出較好的相關(guān)一致性。

病毒含量測(cè)定；效力檢驗(yàn)；痘型大??；持續(xù)時(shí)間

山羊痘是由山羊痘病毒屬山羊痘病毒引起的一種高度接觸性、病毒性傳染病。其特征為發(fā)熱、呼吸困難、無(wú)毛或少毛部位皮膚黏膜發(fā)生丘疹和皰疹，是家畜中最嚴(yán)重的一種痘病，發(fā)病率達(dá)50%～80%，病死率達(dá)20%～75%，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大危害。治療山羊痘病毒無(wú)特效藥，目前主要用山羊痘弱毒疫苗預(yù)防。我公司利用1～3月齡綿羊睪丸制備細(xì)胞生產(chǎn)山羊痘活疫苗已有近三十年歷史，生產(chǎn)工藝成熟，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，效力檢驗(yàn)用病毒含量測(cè)定與羊檢驗(yàn)兩種方法均表現(xiàn)出與《獸用生物制品制造與檢驗(yàn)規(guī)程》較好的相關(guān)一致性。但近兩年生產(chǎn)的山羊痘活疫苗在病毒含量測(cè)定和用羊檢驗(yàn)兩方法進(jìn)行效力檢驗(yàn)時(shí)，出現(xiàn)病毒含量測(cè)定達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，用羊檢驗(yàn)痘型小、不明顯，持續(xù)時(shí)間短的問(wèn)題，給生產(chǎn)帶來(lái)困惑。為探究本問(wèn)題，2011年起本公司生產(chǎn)人員從種毒病毒含量測(cè)定與最小發(fā)痘量是否一致性上，探究生產(chǎn)毒液的病毒含量測(cè)定與痘型是否與種毒有關(guān)，同時(shí)針對(duì)其差異，2012年從種毒細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液、增加單位體積內(nèi)接毒量、接毒后維持液量與以往比減少方面進(jìn)行改進(jìn)，最終使種毒及生產(chǎn)毒液病毒含量測(cè)定與用羊檢驗(yàn)表現(xiàn)出較好的相關(guān)一致性，達(dá)到規(guī)程規(guī)定。

1 種毒及復(fù)壯種毒病毒含量測(cè)定與最小發(fā)痘量相關(guān)一致性對(duì)比試驗(yàn)

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 羊睪丸來(lái)源

烏魯木齊市郊區(qū)永豐鄉(xiāng)3月齡內(nèi)健康雄性羔羊。

1.1.2 種毒來(lái)源

2011年生產(chǎn)使用AV41 0.5 mL/支（2008.9.26）1支，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

2012年生產(chǎn)使用AV41 0.5 mL/支（2008.9.26）1支，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；AV41（2008.9.26，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）繁殖一代細(xì)胞凍干毒（2010年6月22日自備凍干）1 mL/瓶*3瓶。

1.1.3 主要器材和設(shè)備

冰箱（海爾BCD216TDZA）、倒置顯微鏡（OLYPUS公司生產(chǎn)的BDS-300）、克氏瓶、15 000 mL血清瓶、96孔細(xì)胞板。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

山羊，購(gòu)自新疆米泉市未患山羊痘、未接種過(guò)羊痘疫苗的山羊。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 2011年及2012年種毒繁殖復(fù)壯毒液毒價(jià)測(cè)定對(duì)比試驗(yàn)

將凍干種毒按含毒組織量用乳漢液10倍稀釋?zhuān)醇?xì)胞生長(zhǎng)液的1%～2%（2011年每只干毒接2個(gè)克氏瓶，2012年每只干毒接1個(gè)克氏瓶），接種至綿羊睪丸單層細(xì)胞培養(yǎng)良好的克氏瓶、細(xì)胞瓶中，37℃吸附1 h，傾去毒液（接種濕毒不傾毒），加入細(xì)胞維持液（2011年接毒量維持在1.5%～2.0%，轉(zhuǎn)瓶維持液量在1 400～1 500 mL/瓶，2012年接毒量維持在2.7%～3.0%，轉(zhuǎn)瓶維持液量在1 000～1 100 mL/瓶），置37℃培養(yǎng)、觀(guān)察，待細(xì)胞產(chǎn)生以圓縮為特征的病變時(shí)收獲毒液并測(cè)定毒價(jià)[1]。

本實(shí)驗(yàn)2011年生產(chǎn)用1支干毒分別復(fù)壯了3代基礎(chǔ)種毒毒液；2012年生產(chǎn)用1支干毒、一支自備凍干毒分別復(fù)壯了3代基礎(chǔ)種毒毒液，病毒含量測(cè)定結(jié)果如表1、表2。

表1 2011年生產(chǎn)用種毒及基礎(chǔ)毒液病毒含量測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表2 2012年生產(chǎn)用種毒及基礎(chǔ)毒液病毒含量測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)

1.2.2 2011年及2012年毒種繁殖復(fù)壯各代次最小發(fā)痘量對(duì)比試驗(yàn)

用生理鹽水將毒種及復(fù)壯毒液按含毒組織量做10倍系列稀釋?zhuān)?0-3、10-4、10-53個(gè)稀釋度，每個(gè)滴度胸腹部皮內(nèi)注射1～4歲健康易感山羊3只（本實(shí)驗(yàn)是在每只羊體上同時(shí)注射10-3、10-4、10-53個(gè)滴度），每個(gè)滴度2顆，每顆0.5 mL。觀(guān)察15 d，其10-4、10-5稀釋度至少應(yīng)有一只羊發(fā)痘[1][2]。對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果如表3、表4。

表3 2011年生產(chǎn)用種毒及復(fù)壯基礎(chǔ)毒液羊體最小發(fā)痘量統(tǒng)計(jì)表

表4 2012年生產(chǎn)用種毒及復(fù)壯基礎(chǔ)毒液羊體最小發(fā)痘量統(tǒng)計(jì)表

1.2.3 2011年、2012年毒種及復(fù)壯毒液小結(jié)

1.2.3.1 病毒含量測(cè)定 無(wú)論是2011年所用1支干毒，還是2012年所用兩支干毒 （其中一支為自備毒），在羊睪丸單層細(xì)胞上復(fù)壯一代時(shí)，每0.1 mL病毒含量均達(dá)到104.5TCID50以上。復(fù)壯到第三代時(shí)，每0.1 mL病毒含量均達(dá)到105.0TCID50以上，毒價(jià)一代比一代高，呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，符合病毒傳代規(guī)律，達(dá)到規(guī)程規(guī)定。試驗(yàn)顯示病毒含量與單位體積內(nèi)所接毒液含量多少無(wú)關(guān)。

1.2.3.2 最小發(fā)痘量檢驗(yàn)結(jié)果 2011年所用中檢所干毒及復(fù)壯種毒在羊體上10-3稀釋度全部發(fā)痘，10-4稀釋度至少有兩只山羊發(fā)痘，10-5稀釋度至少有一只山羊發(fā)痘，符合規(guī)程規(guī)定。但無(wú)論哪個(gè)稀釋度，在羊體上均表現(xiàn)痘型小、持續(xù)時(shí)間短（痘型直徑在0.6 cm左右，大多持續(xù)時(shí)間在1.5 d以?xún)?nèi)），與2009年前用G42-56（1995.6.14）或G14-STV44-55（2003.03.12）種毒生產(chǎn)表現(xiàn)出的痘型大,持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)（痘型直徑在1.5～3 cm左右，痘型持續(xù)在4～6 d左右）有較大差異。

2012年所用中檢所與自備凍干毒及復(fù)壯種毒在增加每瓶接毒含量、減少每瓶維持液量上做改進(jìn)，在羊體上10-3稀釋度全部發(fā)痘；10-4稀釋度至少有兩只山羊發(fā)痘；10-5稀釋度至少有一只山羊發(fā)痘，符合規(guī)程規(guī)定。2012年生產(chǎn)無(wú)論哪個(gè)稀釋度，在羊體上表現(xiàn)痘型大、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，（痘型直徑在1.5～1.8 cm左右，持續(xù)時(shí)間維持在4～5 d左右），基本接近2009年以前生產(chǎn)出現(xiàn)的痘型和持續(xù)時(shí)間，說(shuō)明種毒在復(fù)壯過(guò)程中增加每瓶接毒含量、減少每瓶維持液量可在痘型反應(yīng)上表現(xiàn)出與病毒含量測(cè)定較好的一致性。

注：2009年前用G42-56（1995.6.14）或G14-STV44-55（2003.03.12）種毒繁殖及其復(fù)壯，其接毒量和維持液量與2011年生產(chǎn)過(guò)程相同。

2 生產(chǎn)毒液、成品病毒含量測(cè)定與羊體檢驗(yàn)相關(guān)一致性對(duì)比試驗(yàn)

2.1 試驗(yàn)材料

羊睪丸（來(lái)自烏魯木齊市永豐鄉(xiāng)郊區(qū)3月齡內(nèi)健康雄性羔羊）、犢牛血清（蘭州民海、內(nèi)蒙金源康）、MEM（Gibco）、乳漢液（本公司自制）等。

2.2 主要器材和設(shè)備

倒置顯微鏡（OLYPUS公司生產(chǎn)的BDS-300）、剪刀、鑷子、15 000 mL血清瓶、移液槍、96孔細(xì)胞板等。

2.3 試驗(yàn)動(dòng)物

山羊，購(gòu)自新疆米泉市未患山羊痘、未接種過(guò)羊痘疫苗的山羊。

2.4 試驗(yàn)方法

2.4.1 2011年及2012年生產(chǎn)毒液病毒含量測(cè)定對(duì)比試驗(yàn)（見(jiàn)表5）

按山羊痘活疫苗細(xì)胞制備、接毒、收獲操作規(guī)程生產(chǎn)毒液，只改變每瓶接毒含量及每瓶維持液量，毒液收獲后各批次毒液混勻后取樣測(cè)定毒價(jià)，生產(chǎn)毒液放置-15℃冷庫(kù)保存?zhèn)溆谩?/p>

表5 2011年及2012年生產(chǎn)毒液病毒含量測(cè)定結(jié)果對(duì)比表

2.4.2 2011年及2012年成品病毒含量與羊體檢驗(yàn)相關(guān)性對(duì)比試驗(yàn)

本試驗(yàn)隨機(jī)抽取本公司生產(chǎn)毒液各4批 8個(gè)小樣，2011年、2012年分別按每瓶?jī)龈刹《竞?.1 mL，每瓶?jī)龈煞盅b量2.2 mL凍干后，按《中華人民共和國(guó)獸藥典》2010版進(jìn)行病毒含量測(cè)定與羊檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 2011年及2012年生產(chǎn)毒液凍干后病毒含量測(cè)定與用羊檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)比表

2.4.3 2011年及2012年生產(chǎn)用毒液檢驗(yàn)小結(jié)

生產(chǎn)用毒液及凍干后樣品病毒含量測(cè)定無(wú)論是2011年生產(chǎn)還是2012年生產(chǎn)，每瓶接毒含量、接毒后維持液量增加或減少后，凍干前后毒價(jià)無(wú)明顯差異，均達(dá)到獸用生物制品規(guī)定，符合標(biāo)準(zhǔn)。

生產(chǎn)毒液用羊檢驗(yàn)，顯示2012年生產(chǎn)毒液痘型大小及持續(xù)時(shí)間明顯高于2011年生產(chǎn)毒液，與獸用生物制品規(guī)程更趨于一致，即2012年生產(chǎn)毒液病毒含量測(cè)定與用羊檢驗(yàn)相關(guān)一致性?xún)?yōu)于2011年生產(chǎn)毒液，接近2009年前生產(chǎn)毒液用羊檢驗(yàn)的痘型和持續(xù)時(shí)間。

3 討 論

《獸醫(yī)生物制品制造與檢驗(yàn)規(guī)程》2000版、《中華人民共和國(guó)獸獸藥典》2010版三部規(guī)定，山羊痘活疫苗生產(chǎn)中成品苗檢驗(yàn)選取病毒含量測(cè)定與用羊檢驗(yàn)中的任一方法均可。本試驗(yàn)中無(wú)論種毒還是生產(chǎn)用毒病毒含量測(cè)定均可達(dá)標(biāo)，用羊檢驗(yàn)卻表現(xiàn)與規(guī)程規(guī)定有差異，因此本文討論的病毒含量測(cè)定與用羊檢驗(yàn)的相關(guān)一致性是指同時(shí)符合這兩個(gè)條件的效力檢驗(yàn)。

一般來(lái)說(shuō)，用羊檢驗(yàn)不應(yīng)在羊體表現(xiàn)全身發(fā)痘，同時(shí)痘腫不應(yīng)出現(xiàn)紫紅色、嚴(yán)重水腫、化膿、結(jié)痂、全身嚴(yán)重反應(yīng)等現(xiàn)象，而應(yīng)在注痘部位出現(xiàn)直徑0.5～3.0 cm微紅色或無(wú)色痘腫反應(yīng)，且持續(xù)4 d以上逐漸消退，發(fā)痘羊間或可有輕度體溫反應(yīng)，但精神食欲應(yīng)正常。 王紹華等《山羊痘弱毒疫苗的研究（第一報(bào)）（第二報(bào)）中以此表示毒株毒力穩(wěn)定、安全性、免疫原型良好。但本文中2011年生產(chǎn)種毒及毒液在羊體上均表現(xiàn)痘型小或不明顯，在規(guī)程規(guī)定下限、持續(xù)時(shí)間僅有1～1.5 d，與規(guī)程規(guī)定有差異，也就意味生產(chǎn)毒株毒力弱或免疫原型不良[3][4]。

增加單位體積內(nèi)的接毒量培養(yǎng)收獲的病毒液，無(wú)論種毒還是生產(chǎn)毒液用病毒含量測(cè)定無(wú)明顯差異，均在規(guī)程規(guī)定范圍，但在用羊檢驗(yàn)上表現(xiàn)出1.9～2.3 cm的痘型，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)（達(dá)4 d以上，相對(duì)于2011年而言），更符合規(guī)程規(guī)定，說(shuō)明在實(shí)際生產(chǎn)中通過(guò)增加單位體積的病毒含量培養(yǎng)病毒，在羊體上是可以達(dá)到規(guī)程規(guī)定的痘型大小及持續(xù)時(shí)間，換言之，能增強(qiáng)山羊痘活疫苗的免疫原性[3][4]。

本公司在2012年生產(chǎn)中，注重種毒的繁殖復(fù)壯，改變以往種毒繁殖一直用乳漢液為現(xiàn)今的MEM-水解乳蛋白液，使種毒在繁殖復(fù)壯時(shí)營(yíng)養(yǎng)液優(yōu)于往年，雖然在病毒含量測(cè)定上未與往年顯現(xiàn)明顯差異，但在羊體痘型和持續(xù)時(shí)間上達(dá)到規(guī)程規(guī)定，說(shuō)明種毒繁殖復(fù)壯營(yíng)養(yǎng)條件的改變對(duì)后續(xù)生產(chǎn)毒液病毒含量測(cè)定無(wú)明顯影響，但用羊檢驗(yàn)上會(huì)在痘型大小、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短上有影響。

生產(chǎn)過(guò)程反復(fù)驗(yàn)證，1～3月齡綿羊羔睪丸最適合制備生長(zhǎng)良好的致密單層細(xì)胞，綿羊羔超過(guò)3月齡、羊睪丸過(guò)大、凈重超過(guò)20 g，細(xì)胞生長(zhǎng)形成的單層不致密，貼壁細(xì)胞不均勻，每平方單位內(nèi)的有效細(xì)胞數(shù)少，收毒量少，毒價(jià)低，對(duì)產(chǎn)品免疫原性有影響，本文是在確保此生產(chǎn)條件下進(jìn)行的病毒含量測(cè)定與用羊檢驗(yàn)試驗(yàn)[5]。

在今后生產(chǎn)中，制備致密、生長(zhǎng)良好的羊睪丸單層細(xì)胞；用MEM-水解乳蛋白營(yíng)養(yǎng)液制備細(xì)胞、增加單位體積內(nèi)的接毒量培養(yǎng)收獲病毒液，是增強(qiáng)山羊痘活疫苗成品用羊效力檢驗(yàn)痘型大小、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短的有效措施，能使病毒含量測(cè)定與用羊檢驗(yàn)保持其較好的相關(guān)一致性，使產(chǎn)品更能符合規(guī)程規(guī)定，達(dá)到較好的免疫效果。

[1]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：46-148.

[2]中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典（2010版三部）[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010：61-62.

[3]王紹華,江煥賢.山羊痘弱毒疫苗的研究(第一報(bào))山羊痘弱毒細(xì)胞株的培育[J].獸醫(yī)藥品通訊，1984，(02).

[4]王紹華,江煥賢.山羊痘弱毒疫苗的研究(第二報(bào))山羊痘弱毒細(xì)胞培養(yǎng)凍干疫苗的研究[J].獸醫(yī)藥品通訊，1985，(02).

[5]康廣平,符子華,蔣曉玲,等.羔羊睪丸大小對(duì)山羊痘細(xì)胞苗生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)影響[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004,(S1).

The Comparative Tests for the Assay of Goat Pox Living Vaccine and its Potency

HE Yu-xian1，KANG Guang-ping1，LU Li-zhu1，HUANG Jiong2
（1.Xinjiang Tiankang Animal Husbandry Biotechnology Limited Liability Company，Urumqi 830032，China；2.Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi 830000,China）

In the past two years the company live goat pox vaccine production optional one method of?the virus content determination and the efficacy test,the virus content reach the standard"veterinary biological products manufacturing and inspection procedures",but efficacy test appear small pox,not obvious,time is short.Against this phenomenon of the company by increasing the seed virus of sheep testis cell nutrient fluid to improve viral content per unit volume,harvested venom achieved viral load determination of compliance and effectiveness testing of smallpox in large,obvious,and lasts long,associated with the procedures demonstrated a good deal of consistency.

virus content determination；efficacy test；pimple size；duration

S852.65+4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1003-6377（2014）04-0048-05

2014-03-20

何玉仙（1967-），女，獸醫(yī)碩士，獸醫(yī)師職稱(chēng)，從事獸用疫苗生產(chǎn)。