冉君,尹磊淼,王宇,徐玉東,劉艷艷,楊永清

(1.上海中醫(yī)藥大學,上海 201203;2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030)

·綜 述·

針刺抗哮喘差異表達蛋白的生物信息學分析

冉君1,尹磊淼2,王宇2,徐玉東2,劉艷艷2,楊永清1

(1.上海中醫(yī)藥大學,上海 201203;2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030)

目的對針刺抗哮喘差異表達蛋白的生物學功能和分子網(wǎng)絡(luò)進行分析,探討生物信息學方法在針灸研究中的應(yīng)用和思路。方法利用分類系統(tǒng)(PANTHER)、信號通路交互作用數(shù)據(jù)庫(Pathway Interaction Database,PID)、分子網(wǎng)絡(luò)作用軟件(Ingenuity Pathway Analysis,IPA)分別對針刺抗哮喘差異表達蛋白進行分子生物功能注釋、信號通路、蛋白相互作用和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果多個針刺抗哮喘差異表達蛋白與免疫系統(tǒng)功能密切相關(guān),涉及了RhoA信號通路、Toll樣受體信號通路、嗜酸性粒細胞Ccr3信號通路、T細胞IL-2R beta活化通路等生物通路,通過調(diào)控下游細胞因子,影響CD4分子的功能,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)論通過對針刺抗哮喘差異表達蛋白的生物信息學分析獲得了針刺抗哮喘作用免疫相關(guān)分子通路和調(diào)控靶點,為進一步研究針刺抗哮喘的免疫相關(guān)分子機制奠定基礎(chǔ)。

針刺;哮喘;差異表達蛋白;生物信息學

支氣管哮喘是世界范圍內(nèi)嚴重影響人類身心健康的呼吸道慢性變態(tài)反應(yīng)性疾病,全球約有3億人罹患哮喘,我國大約有3 000萬哮喘患者,其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)呈逐年增高趨勢[1-2]。針灸在防治哮喘的過程中發(fā)揮了積極作用[3-5],我們采用河南中醫(yī)學院邵經(jīng)明教授60余年經(jīng)驗總結(jié)的“三穴五針”方法治療哮喘[6],取得了良好的臨床療效。臨床和動物實驗研究均證實針刺治療具有免疫調(diào)節(jié)作用。本課題組前期開展了針刺抗哮喘差異蛋白質(zhì)組學研究,鑒定了針刺抗哮喘血清和肺組織中的差異表達蛋白[7-8]。本次研究采用生物信息學分析方法,利用PANTHER、PID、IPA等在線分析工具對這些針刺抗哮喘差異表達蛋白進行生物功能和分子網(wǎng)絡(luò)作用分析,為進一步研究針刺抗哮喘分子機制和調(diào)節(jié)靶點提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 針刺抗哮喘差異表達蛋白

針刺抗哮喘差異表達蛋白來自課題組前期通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)鑒定的針刺治療哮喘特異性差異表達蛋白[7-8],見表1。

1.2 生物信息學分析方法

1.2.1 GO(基因本體)分子生物功能注釋

在線分類系統(tǒng)PANTHER(http://www.pantherdb. org/)采用基因本體分類方法,可以從分子功能、生物學過程、生物通路3方面對蛋白質(zhì)、基因及轉(zhuǎn)錄物進行分類。該研究主要是通過PANTHER分析針刺抗哮喘差異表達蛋白所涉及的生物學過程。

表1 針刺抗哮喘差異表達蛋白

1.2.2 信號通路分析

通路相互作用數(shù)據(jù)庫PID(Pathway Interaction Database,http://pid.nci.nih.gov/),是由美國國立癌癥研究所(NCI)和自然出版集團(NPG)共同創(chuàng)立,截止到2012年9月提供了16 823條細胞信號轉(zhuǎn)導、調(diào)節(jié)活動及主要細胞生命的蛋白質(zhì)路徑信息[9]。本次研究通過該數(shù)據(jù)庫查詢針刺抗哮喘差異表達蛋白所涉及的信號通路。

1.2.3 蛋白相互作用分析

IPA(Ingenuity Pathway Analysis,http://www. qiagen.com/)是一款一體化的基于網(wǎng)絡(luò)的軟件應(yīng)用程序,可實現(xiàn)基因表達、miRNA和SNP微陣列及代謝組學、蛋白質(zhì)組學和RNAseq實驗數(shù)據(jù)的分析、整合和理解。該軟件已被世界頂尖的制藥公司和科研機構(gòu)廣泛使用,至今引用該軟件發(fā)表的高水平科研文獻已超過3 000 篇[10]。本研究主要選擇該軟件核心分析功能(Core analysis),構(gòu)建了蛋白相互作用可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

IPA軟件整合了基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組,以及生物大分子之間及與藥物小分子的相互作用網(wǎng)絡(luò),通過IPA路徑挖掘(Path Explorer)功能可以對目的分子進行特定靶點、分子上下游調(diào)控、候選生物標記物、藥物毒性分析等。本次研究主要對針刺抗哮喘差異表達蛋白進行分子上下游調(diào)控分析。

2 結(jié)果

2.1 針刺抗哮喘差異表達蛋白GO生物功能

通過PANTHER在線分析工具對針刺抗哮喘差異表達蛋白進行生物學過程功能注釋。結(jié)果顯示見圖1。這些差異表達蛋白主要涉及了代謝過程、細胞過程、細胞定位、免疫系統(tǒng)過程、細胞組成和生源、生物進展過程、生物調(diào)節(jié)、生物粘附、應(yīng)激反應(yīng)9類生物學功能。其中免疫系統(tǒng)功能分類中包括了CypA、S100A8、S100A9、S100A11、RAGE等針刺抗哮喘差異表達蛋白,說明針刺抗哮喘效應(yīng)與這幾個蛋白的免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)。

圖1 基于PANTHER分類系統(tǒng)的針刺抗哮喘差異表達蛋白生物功能分類

2.2 針刺抗哮喘差異蛋白信號通路

通過PID數(shù)據(jù)庫對針刺抗哮喘差異表達蛋白分布的信號轉(zhuǎn)導通路進行分析。結(jié)果見表2,針刺抗哮喘差異蛋白主要參與RhoA信號通路(RhoA signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Endogenous TLR signaling)、嗜酸性粒細胞Ccr3信號通路(Ccr3 signaling in eosinophils)、細胞粘附通路(Cell to cell adhesion signaling)、T細胞IL-2R beta活化通路(Il-2 receptor beta chain in t cell activation)、整合素信號通路(Integrin signaling pathway)等生物通路。這些信號通路與免疫、炎癥、T細胞和嗜酸性粒細胞活化作用密切相關(guān),說明針刺可以通過調(diào)節(jié)這些信號通路發(fā)揮抗哮喘作用。

表2 基于PID數(shù)據(jù)庫的針刺抗哮喘差異表達蛋白信號通路分析

2.3 針刺抗哮喘差異表達蛋白相互作用分析

將針刺抗哮喘差異表達蛋白用IPA軟件進行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)其中有10個針刺抗哮喘差異表達蛋白存在直接或間接的相互作用關(guān)系。詳見圖2。該網(wǎng)絡(luò)圖顯示,這10個差異表達蛋白分布在細胞的各個部位,如位于細胞膜外的CC10、Alb、Prss1,細胞膜上的Anxa5、RAGE,細胞質(zhì)中的Prdx6、CypA、S100A8、S100A9以及細胞核中的Cfl1蛋白,這為針刺的信號傳導提供了空間基礎(chǔ);其中CC10、CypA、RAGE可以調(diào)節(jié)其他多個蛋白,說明這兩個蛋白在針刺抗哮喘過程中可能具有上游的調(diào)節(jié)作用,而S100A8、S100A9則受到多個蛋白的調(diào)節(jié),提示這兩個蛋白在針刺抗哮喘過程中可能具有下游的效應(yīng)作用。

圖2 基于IPA軟件的針刺抗哮喘差異表達蛋白的蛋白-蛋白相互作用

綠色分子是針刺抗哮喘差異表達蛋白,白色分子是組建網(wǎng)絡(luò)所需分子。實線表示直接聯(lián)系,虛線表示間接聯(lián)系,箭頭表示作用方向。

2.4 針刺抗哮喘差異蛋白分子調(diào)控分析

利用IPA路徑挖掘功能對CC10、S100A8、CypA幾個關(guān)鍵蛋白進行分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果顯示見圖3,CC10蛋白受到糖皮質(zhì)激素的上游調(diào)節(jié),而影響下游的聯(lián)蛋白1(ANXA1)、核轉(zhuǎn)錄因子kB(NFkB)、嗜酸粒細胞趨化蛋白Eotaxin1(CCL11)、IFN-γ、補體C3(C3)、前列腺素內(nèi)過氧化物酶2(PTGS2)、維連接蛋白1(FN1)以及細胞因子IL-4、IL-5、IL-13;S100A8蛋白受到鈣離子(Ca2﹢)、S100A9的調(diào)節(jié),能夠影響下游Toll樣受體4(TLR4)、非受體酪氨酸激酶(TEK)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、心肌素樣蛋白2(MKL2)、免疫球蛋白、精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(PRMT1)以及細胞因子IL-4、IL-10、IL-13等;CypA受到過氧化氫(H2O2)、PRDX6、環(huán)孢菌素A(CsA)的上游調(diào)節(jié),影響了下游基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、NFkB、纖維蛋白原(FNG)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、細胞分裂周期蛋白42(CDC42)、TEK、PRDX6、FN1、Cfl1以及細胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-13和趨化因子CCL3(巨噬細胞炎性蛋白1α)、CCL5(受激活調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌因子)等。值得注意的是3個蛋白均可以調(diào)節(jié)多種細胞因子,對CD4產(chǎn)生調(diào)控作用,而CD4細胞又是免疫系統(tǒng)中最重要的免疫細胞;此外CypA、CC10蛋白又與T細胞相關(guān)趨化因子CCL3、CCL5、CCL11相關(guān),說明針刺抗哮喘效應(yīng)可能通過針刺抗哮喘差異表達蛋白對CD4分子的調(diào)控作用而發(fā)揮,它可能是針刺抗哮喘的作用靶點。

圖3 基于IPA軟件的針刺抗哮喘差異表達蛋白分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(實線表示直接關(guān)系,虛線表示間接關(guān)系)

3 討論

生命科學是21世紀前沿學科,隨著人類基因組遺傳圖、物理圖的相繼完成,功能基因組和蛋白質(zhì)組研究成為后基因時期主要研究熱點。針灸學是生命科學的分支學科之一,針灸研究也是生命科學研究的一個重要組成部分。利用生命科學的理論、技術(shù)與方法來研究針灸效應(yīng),可以為針灸作用分子途徑和機制研究提供新的線索,更好地闡述針灸效應(yīng)這一生命活動現(xiàn)象。

蛋白質(zhì)是機體細胞功能的主要執(zhí)行者,對大多數(shù)蛋白質(zhì)都是以多個蛋白質(zhì)相互作用的形式完成不同的細胞功能。針刺抗哮喘差異表達蛋白功能分類顯示,CypA、S100A8、S100A9、S100A11、RAGE等差異表達蛋白與機體免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān),并與RAGE、Alb、Cf1等蛋白具有直接或間接的相互作用關(guān)系,涉及了RhoA信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞IL-2R beta活化通路、嗜酸性粒細胞Ccr3信號通路等生物通路。其中RhoA信號通路與氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性[11]密切相關(guān);Toll樣受體信號通路可以激活天然免疫,是誘導T細胞分化的關(guān)鍵因子,能夠促進Th0細胞向Th1細胞分化[12];T細胞IL-2R beta的活化能夠促進調(diào)節(jié)性T細胞的分化;嗜酸性粒細胞Ccr3信號通路對Th2型免疫反應(yīng)嗜酸性粒細胞聚集、脫顆粒具有重要調(diào)節(jié)作用。這些差異表達蛋白和信號通路的改變,說明針刺刺激機體后能夠調(diào)節(jié)免疫相關(guān)蛋白,并通過協(xié)同作用將信號傳遞至胞內(nèi),調(diào)節(jié)免疫、炎癥信號通路發(fā)揮抗哮喘作用。

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病,Th1/Th2和Th17/Treg平衡理論是哮喘發(fā)病機制的核心。CD4分子在哮喘氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用,CD4分子主要表達于輔助T細胞,參與Th細胞TCR識別抗原的信號轉(zhuǎn)導,初始CD4﹢T細胞可分化為Th1、Th2、Th17和Treg4種調(diào)節(jié)性T細胞亞型,而細胞因子微環(huán)境決定了初始CD4﹢T細胞的分化傾向。分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析顯示CC10、CypA、S100A8等針刺抗哮喘差異表達蛋白可以對下游IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13 和IL-17等細胞因子產(chǎn)生調(diào)控作用,并有可能改變Th細胞的外周因子環(huán)境,影響初始CD4﹢T細胞的分化,進而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。通過分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以發(fā)現(xiàn)CD4分子是針刺抗哮喘效應(yīng)的靶點分子,不僅受到一種差異表達蛋白的影響,多個差異蛋白均參與了這一調(diào)節(jié)作用,這為針刺的雙向免疫調(diào)節(jié)作用提供了理論依據(jù)。

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Bioinformatic Analysis of Differentially Expressed Proteins in Anti-asthma Acupuncture

RAN Jun1, YIN Lei-miao2, WANG Yu2, XU Yu-dong2, LIU Yan-yan2, YANG Yong-qing1. 1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China; 2. Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian,Shanghai 200030,China

ObjectivTo analyze the biological functions and molecular networks of differentially expressed proteins in anti-asthma acupuncture and explore the application of bioinformatic methods to and ideas for acupuncture research. Methods PANTHER classification system, Pathway Interaction Database (PID) and Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software were used for molecular biological function annotation of differentially expressed proteins in anti-asthma acupuncture and analyses of signaling pathways, protein-protein interactions and molecular regulatory networks.ResultsSeveral differentially expressed proteins in anti-asthma acupuncture were closely related to immune system function and involved in biological pathways including RhoA signaling pathway, Toll-like receptor signaling pathway, eosinophils Ccr3 signaling pathway and T cell IL-2R beta activation pathway. They produced an immunoregulatory effect by modulating downstream cytokines and influencing CD4 molecule function).ConclusionsImmune-related molecular pathways and regulation targets involved in the anti-asthma effect of acupuncture are obtained by bioinformatic analysis of differentially expressed proteins in anti-asthma acupuncture, which provides a basis for further research on the immune-related molecular mechanisms of acupuncture treatment for asthma.

Acupuncture; Asthma; Differentially expressed protein; Bioinformatics

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.09.0875

1005-0957(2014)09-0875-04

2014-02-25

國家自然科學基金項目(81173341;81173332;81202753);上海市青年科技啟明星計劃(12QA1403000);上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年人才培養(yǎng)計劃(XYQ2013081);上海市教委預(yù)算內(nèi)科研項目(2011JW49)

冉君(1984 - ),男,2011級博士生

楊永清(1964 - ),男,博士生導師,E-mail:dryqyang@163.com