李湘楚，熊建光，程正位，吳 娟 ，劉啟勝

咸寧市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北咸寧437000

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，胃癌發(fā)病率位居惡性腫瘤的第四位，其死亡率位居第二位，僅次于肺癌。據(jù)估計(jì)，在2008年全球約有100萬新發(fā)胃癌病例，其中70%的胃癌病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，大約50%以上的新發(fā)胃癌病例在中國(guó)［1］。眾所周知，幽門螺桿菌(H.pylori)感染被認(rèn)為是胃癌的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素，全球大約有50%的人感染H.pylori，但在感染者中只有約1%的人發(fā)展為胃癌［2］。因此，胃癌的發(fā)展不是由單一因素導(dǎo)致，它是環(huán)境、遺傳及其他多因素共同作用的結(jié)果。

白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一種多功能的細(xì)胞因子，在體內(nèi)可對(duì)多種細(xì)胞功能產(chǎn)生影響，其宿主遺傳學(xué)基因的不穩(wěn)定性能夠增加促癌基因的激活及腫瘤的抑癌基因失活，最終導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)［3］。臨床研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者的血清中，腫瘤組織的IL-6水平顯著性增高［4］。因此，推測(cè)IL-6基因多態(tài)性可能對(duì)腫瘤的易感性起到了重要的作用。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6 174G/C和IL-6 572G/C單核苷酸多態(tài)性的G到C突變能夠影響IL-6的基因轉(zhuǎn)錄，因而腫瘤組織中的IL-6水平顯著性的高于對(duì)照組［5］。本地為胃癌高發(fā)地區(qū)，IL-6 174G/C和IL-6 572G/C基因多態(tài)性與胃癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)關(guān)系尚不清楚，另外，IL-6 174G/C和IL-6 572G/C基因多態(tài)性是否與H.pylori感染有交互作用也尚不清楚。本研究的目的是評(píng)價(jià)本地區(qū)IL-6 174G/C和IL-6 572G/C基因多態(tài)性與胃癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)關(guān)系，以及IL-6基因多態(tài)性與H.pylori感染和吸煙的交互作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年1月-2011年5月咸寧市中心醫(yī)院新發(fā)胃癌246例，男152例，女94例，平均年齡(55.7±8.3)歲。所有患者均由病理所證實(shí)。納入同一時(shí)間在咸寧市中心醫(yī)院體檢的非腫瘤患者作為對(duì)照組，共274例，男179例，女95例，平均年齡(56.3±8.5)歲。所納入的對(duì)照組經(jīng)過體檢證實(shí)無任何腫瘤病史。胃癌組和對(duì)照組的人口學(xué)特征均由自行設(shè)計(jì)的問卷，采用一對(duì)一問卷方式收集相關(guān)信息，包括性別、年齡、吸煙和飲酒情況。

1.2 幽門螺桿菌檢測(cè) 納入的病例組和對(duì)照組均提取靜脈血2 ml，分離血清，-20℃低溫保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清H.pylori IgG，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 DNA提取及分型 所有研究對(duì)象空腹抽取靜脈血5 ml，12 000 rpm離心2 min。將DNA溶液轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎肨IANamp blood DNA kit(天根生化科技有限公司，北京，中國(guó))試劑盒提取人白細(xì)胞DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳法判定DNA提取是否成功。

IL-6 174G/C和-572G/C位點(diǎn)引物采用Sequenom公司Assay Design 3.1 Software軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。IL-6 174G/C正向引物為5＇-GGAGTC ACA CAC TCC ACC T-3＇反向引物為 5＇-CTG ATT GGA AAC CTTATT AAG-3＇。IL-6 572G/C 正向引物為 5＇-CTA AGT GGG CTG AAG CAG GT-3＇，反向引物為 5＇-TCA TGG GAA AAT CCC ACA TT-3＇。采用聚合酶反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)方法測(cè)定IL-6 174G/C和IL-6 572G/C的基因分型。PCR擴(kuò)增按照以下條件進(jìn)行:反應(yīng)體系為 20 μl，包括基因組 DNA 200 ng，dNT 1.0 μl，引物各 100 pmol，Taq DNA polymerase(0.2 U/μl)0.2 μl，10 × Ex Taq Buffer 5 μl，DNA 模板 1.0 μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s、64℃退火30 s、72℃延伸進(jìn)行60 s，總共重復(fù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物在4℃情況下保存，經(jīng)過2%瓊脂堂凝膠電泳后，采用溴乙錠染色檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(SPSS Inc，Chicago，IL，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用±s表示，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比表示。病例組和對(duì)照組臨床資料比較采用χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。基因型頻率采用頻數(shù)和百分比表示，對(duì)照組基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗(yàn)。OR和95%CI用作評(píng)估IL-6 174G/C和IL-6 572G/C基因多態(tài)性與胃癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)關(guān)系。在調(diào)整混雜因素后，采用多變量條件Logistic回歸分析模型評(píng)價(jià)IL-6 174G/C和IL-6 572G/C基因多態(tài)性與胃癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，按照是否感染H.pylori進(jìn)行分層分析評(píng)價(jià)IL-6 174G/C和IL-6 572G/C基因多態(tài)性與H.pylori的交互作用。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 納入的病例組和對(duì)照組的性別和年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，兩組具有可比性。吸煙能顯著性的增加患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)(P＜0.05)，H.pylori陽性感染能顯著性的增加患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)(P＜0.05，見表1)。

表1 病例組和對(duì)照組人口學(xué)特征Tab1 Demographic characteristics of case group and the control group

2.2 IL－6 174G/C和IL－6 572G/C基因頻率分布及比較 IL-6 174GG、GC和CC基因型在病例組頻率為63.4%、21.5%和15.0%，在對(duì)照組中頻率為71.9%、18.2%和9.9%，該基因頻率分布在兩組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.73，P ＜0.05)。IL-6 572GG、GC 和CC基因型在病例組頻率為51.6%、30.9%和17.5%，在對(duì)照組中頻率為57.3%、28.1%和14.6%，兩組基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.78，P＞0.05)。Hardy-Weinberg平衡分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6 572G/C基因型在對(duì)照組中符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=4.64，P＞0.05，見表2)。

以IL-6 174GG基因型作為參照，攜帶IL-6 174C等位基因能顯著性的增高胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，未調(diào)整的OR(95%CI)為1.48(1.01～2.17)。調(diào)整性別、年齡、吸煙、飲酒和 H.pylori感染等混雜因素后，攜帶 IL-6 174CC基因型和C等位基因型能夠顯著性的增加胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，OR(95%CI)分別為1.88(1.07～3.48)和1.56(1.14～2.52)。本研究并未發(fā)現(xiàn)IL-6 572G/C基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)關(guān)系(見表3)。

表2 IL－6 174G/C和IL－6 572G/C基因頻率分布及Hardy－Weinberg平衡［例數(shù)(%)］Tab2 Gene frequencies and Hardy－Weinberg equilibrium between IL－6 gene－174G/C and 572G/C ［n(%)］

表3 IL－6 174G/C和IL－6 572G/C基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病相關(guān)關(guān)系Tab3 The association between the IL－6 gene polymorphisms and risk of gastric cancer

研究還進(jìn)一步分析了IL-6基因多態(tài)性與H.pylori感染及吸煙的交互作用。在H.pylori陽性感染患者中，攜帶IL-6 174GC和CC基因型能顯著性增加患胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，OR(95%CI)分別為1.41(1.05～2.16)和1.89(1.13～3.40)，兩者有交互作用(P＜0.05)。在吸煙人群中，攜帶IL-6 174GC和CC基因也能顯著性的增加患胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，OR(95%CI)分別為1.37(0.94～2.30)和1.92(1.17～3.51)。在非吸煙人群中，這兩個(gè)基因型并不能增加患胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。而對(duì)于IL-6 572G/C基因多態(tài)性，無論在H.pylori感染人群中還是吸煙人群中，均未發(fā)現(xiàn)IL-6 572G/C基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)關(guān)系(見表4)。注:1:調(diào)整性別、年齡、吸煙和飲酒;2:調(diào)整性別、年齡、飲酒和H.pylori感染。

表4 IL－6 174G/C和IL－6 572G/C基因多態(tài)性與H.pylori感染和吸煙交互作用Tab4 The association among the IL－6 gene polymorphisms with H.pylori infection and smoking

3 討論

胃癌是在環(huán)境因素、生物因素及遺傳因素共同作用下，長(zhǎng)時(shí)間相互作用多步驟發(fā)展而導(dǎo)致的［6］，并非所有胃癌高風(fēng)險(xiǎn)的人群都會(huì)患胃癌，而只有一小部分人發(fā)病，說明了在相同的環(huán)境因素下，遺傳因素決定了個(gè)體對(duì)胃癌的易感性。本研究探討了IL-6 174G/C和IL-6 572G/C基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6 174CC基因型能顯著性的增加胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

IL-6位于第7號(hào)染色體，含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，它是一種多效性細(xì)胞因子，在炎癥、骨代謝和腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了重要的作用［7］。在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游第174個(gè)堿基的啟動(dòng)子區(qū)域存在影響血清細(xì)胞因子水平的C-G轉(zhuǎn)變的基因多態(tài)性［8］。此基因多態(tài)性會(huì)在DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中產(chǎn)生差異，從而導(dǎo)致個(gè)體發(fā)病的易感性差異。體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6 174C/G基因多態(tài)性可以調(diào)控IL-6基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)過程，導(dǎo)致個(gè)體對(duì)疾病的易感性差異［9］。IL-6基因多態(tài)性導(dǎo)致了IL-6水平增高，反映了IL-6在疾病、組織和環(huán)境等方面均具有特異性的表達(dá)和調(diào)控［10］。而IL-6 174G/C基因多態(tài)性被證實(shí)與多種疾病有相關(guān)關(guān)系，包括多發(fā)性骨髓瘤、肝癌和子宮內(nèi)膜異位癥等疾?。?1］。本研究結(jié)果表明 IL-6 174G/C基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有顯著關(guān)系。

到目前為止有8個(gè)關(guān)于IL-6 174G/C基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性的研究，其中3個(gè)在亞洲人群中研究，5個(gè)在西方人群中研究［12］。在英國(guó)、美國(guó)的3個(gè)研究均發(fā)現(xiàn)IL-6 174G/C基因多態(tài)性與胃癌風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)關(guān)系［13］。在巴西的研究結(jié)果表明IL-6 174G等位基因能夠增加患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)，而在芬蘭的研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)IL-6 174G等位基因會(huì)降低患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)［14］。而在亞洲的3個(gè)研究中，只有1個(gè)中國(guó)的研究結(jié)果表明IL-6 174G等位基因與C等位基因相比，能顯著性的降低胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)IL-6 174C等位基因能顯著性的增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，與上述研究不一致，表明IL-6基因多態(tài)性存在種族的差異性，在不同的人群和不同的環(huán)境中，IL-6對(duì)疾病具有特異性的表達(dá)和調(diào)控。同時(shí)在本研究中，在H.pylori陽性感染者中IL-6 174C等位基因能顯著性增加胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而在非感染者中并未發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性。說明血清及胃黏膜組織中的IL-6水平在H.pylori陽性感染者中明顯增加，IL-6多態(tài)性參與了胃黏膜損傷的病理過程。

因此，本研究結(jié)果表明IL-6 174G/C基因多態(tài)性可能具有促進(jìn)胃癌發(fā)生和發(fā)展的作用，IL-6 174C等位基因能顯著性的增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。IL-6 174G/C基因多態(tài)性可以作為胃癌遺傳學(xué)的檢測(cè)指標(biāo)，用于胃癌易感個(gè)體的生物學(xué)指標(biāo)。

［1］Zhao P，Dai M，Chen W，et al.Cancer trends in China［J］.Jpn J Clin Oncol，2010，40(4):281-285.

［2］Parsonnet J，F(xiàn)riedman GD，Orentreich N，et al.Risk for gastric cancer in people with CagA positive or CagA negative Helicobacter pylori infection ［J］.Gut，1997，40(3):297-301.

［3］Shi TY，Zhu ML，He J，et al.Polymorphisms of the Interleukin 6 gene contribute to cervical cancer susceptibility in Eastern Chinese women［J］.Hum Genet，2013，132(3):301-312.

［4］Tang LP，Cho CH，Hui WM，et al.An inverse correlation between Interleukin-6 and select gene promoter methylation in patients with gastric cancer［J］.Digestion，2006，74(2):85-90.

［5］Matsuo K，Oka M，Murase K，et al.Expression of interleukin 6 and its receptor in human gastric and colorectal cancers［J］.J Int Med Res，2003，31(2):69-75.

［6］Bonegui P，Meneses-González F，Correa P，et al.Risk factors for gastric cancer in Latin America:a meta-analysis［J］.Cancer Causes Control，2013，24(2):217-231.

［7］Hirano T.Interleukin-6 and its relation to inflammation and disease［J］.Clin Immunol Immunopathol，1992，62(1 Pt 2):S60-S65.

［8］Terry CF，Loukaci V，Green FR.Cooperative influence of genetic polymorphisms on interleukin 6 transcriptional regulation ［J］.J Biol Chem，2000，275(24):18138-18144.

［9］Testa R，Olivieri F，Bonfigli AR，et al.Interleukin-6-174 G＞C polymorphism affects the association between IL-6 plasma levels and insulin resistance in type 2 diabetic patients ［J］.Diabetes Res Clin Pract，2006，71(3):299-305.

［10］Pereira DS，Garcia DM，Narciso FM，et al.Effects of 174 G/C polymorphism in the promoter region of the interleukin-6 gene on plasma IL-6 levels and muscle strength in elderly women［J］.Braz J Med Biol Res，2011，44(2):123-129.

［11］Magalh?es JF，Cortinhas AJ，Albuguergue CM，et al.Interleukin-6 gene-174G＞C and-636G＞C promoter polymorphisms and prostate cancer risk［J］.Mol Biol Rep，2013，40(1):449-455.

［12］Deans C，Rose-Zerilli M，Wigmore S，et al.Host cytokine genotype is related to adverse prognosis and systemic inflammation in gastro-oesophageal cancer［J］.Ann Surg Oncol，2007，14(2):329-339.

［13］El-Omar EM，Rabkin CS，Gammon MD，et al.Increased risk of noncardia gastric cancer associated with proinflammatory cytokine gene polymorphisms［J］.Gastroenterology，2003，124(5):1193-1201.

［14］Kamangar F，Abnet CC，Hutchinson AA，et al.Polymorphisms in inflammation-related genes and risk of gastric cancer(Finland)［J］.Cancer Causes Control，2006，17(1):117-125.

［15］Zhao Y，Xiao Y，Gao F，et al.Relativity research on the association between the interleukin-6 gene polymorphisms and risk of gastric cancer in Wuwei area of Gansu Province ［J］.Clin J Med Offic，2010，38(1):25-27.