張春霖，尚世輝，王瑞剛

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

擬南芥VHA-c基因的礦質(zhì)營養(yǎng)調(diào)節(jié)

張春霖，尚世輝，王瑞剛

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

對(duì)Ca2＋和MS營養(yǎng)處理轉(zhuǎn)VHA-c-GUS煙草葉片的GUS表達(dá)活性進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明：VHA-c2和VHA-c3可被Ca2＋促進(jìn)表達(dá)，而VHA-c5的表達(dá)則被Ca2＋抑制。同時(shí)，MS營養(yǎng)成分可顯著促進(jìn)VHA-c2、VHA-c3和VHA-c5基因的表達(dá)。這說明VHA-c基因可被Ca2＋和MS等營養(yǎng)成分調(diào)控表達(dá)。

擬南芥；VHA-c；GUS；Ca2＋；MS培養(yǎng)基；離子轉(zhuǎn)運(yùn)；Ca2＋／H＋反向傳遞體

0 引言

植物是自養(yǎng)生物，它能夠從環(huán)境中吸收無機(jī)營養(yǎng)，并在體內(nèi)與碳骨架同化合成為自身的組成成分［1］。研究表明：礦質(zhì)營養(yǎng)大多從土壤中以離子的形式經(jīng)過細(xì)胞膜而進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)［2］。有關(guān)這些礦質(zhì)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，在20世紀(jì)30年代以來得到許多有意義的證據(jù)，并有人據(jù)此提出了許多有關(guān)的假說。其中，M itchell在20世紀(jì)60年代提出的化學(xué)滲透學(xué)說，被人們廣為接受。近年的很多研究結(jié)果均支持這個(gè)假說，并把它完善起來［3］。質(zhì)子泵學(xué)說認(rèn)為，質(zhì)子泵的重要功能之一就是水解三磷酸腺苷（ATP），建立跨膜質(zhì)子電化學(xué)梯度，從而驅(qū)動(dòng)物質(zhì)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)［4］。

對(duì)V-ATP酶（V-ATPase）的研究表明：組成V-ATPase的c亞基參與質(zhì)子通道的形成，并負(fù)責(zé)質(zhì)子的轉(zhuǎn)運(yùn)［5－6］。由此，推測V-ATPase的c亞基與礦質(zhì)元素轉(zhuǎn)運(yùn)直接相關(guān)。文獻(xiàn)［7］將播種于1／2 MS液體培養(yǎng)基中的7 d齡擬南芥，移栽在1／200 MS培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)其16 kD c亞基的mRNA水平有所增加，證實(shí)了上述質(zhì)子泵c亞基與礦質(zhì)營養(yǎng)直接有關(guān)的推測。結(jié)果提示：礦質(zhì)營養(yǎng)與質(zhì)子泵c亞基基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。然而，有關(guān)其可能機(jī)制尚不清楚。

本文克隆了編碼擬南芥質(zhì)子泵c亞基基因的3個(gè)調(diào)控序列（VHA-c），通過其在轉(zhuǎn)基因煙草葉片內(nèi)的表達(dá)，試圖探討礦質(zhì)營養(yǎng)對(duì)VHA-c的可能調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 植物材料

普通栽培煙草（Nicotiana tabacum）：革新一號(hào)。轉(zhuǎn)VHA-c2-GUS基因煙草、轉(zhuǎn)VHA-c3-GUS基因煙草和轉(zhuǎn)VHA-c5-GUS基因煙草均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

I0：蒸餾水＋0.7%瓊脂＋3%蔗糖（pH5.8，不含任何生長調(diào)節(jié)物質(zhì)）。

I1：MS（無Ca2＋）＋0.7%瓊脂＋3%蔗糖（pH5.8，不含任何生長調(diào)節(jié)物質(zhì)）。

I2：MS＋0.7%瓊脂＋3%蔗糖（pH5.8，不含任何生長調(diào)節(jié)物質(zhì)）。

在I0、I1和I2培養(yǎng)基中，0.7%瓊脂是指在100 mL培養(yǎng)基中添加0.7 g瓊脂，3%蔗糖是指在100 m L培養(yǎng)基中添加3 g蔗糖。

1.3 試驗(yàn)處理

在無菌狀態(tài)下將野生型煙草葉片分別置于I0、I1和I2培養(yǎng)基中，25℃普通光照條件下培養(yǎng)2 h，作為對(duì)照1；在無菌狀態(tài)下將轉(zhuǎn)基因煙草葉片置于I2培養(yǎng)基中，25℃普通光照條件下培養(yǎng)2 h，作為對(duì)照2；處理時(shí)，在無菌狀態(tài)下將轉(zhuǎn)基因煙草葉片分別置于I0和I1培養(yǎng)基中，25℃普通光照條件下培養(yǎng)2 h后，用50 mmol／L pH7.0磷酸鈉緩沖液沖洗3次。按熒光檢測法檢測GUS表達(dá)活性。

2 結(jié)果分析

2.1 Ca2＋對(duì)VHA-c-GUS基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

普通MS培養(yǎng)基中含有3.41 mmol／L（440 mg／L CaCl2·H2O）Ca2＋［7］。將轉(zhuǎn)VHA-c-GUS基因煙草在含有Ca2＋與不含Ca2＋的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后，比較了其GUS表達(dá)活性。表1為Ca2＋處理下VHA-c-GUS表達(dá)水平的顯著性檢驗(yàn)。表1結(jié)果表明：VHA-c-GUS基因的表達(dá)水平與Ca2＋有關(guān)，表現(xiàn)為VHA-c2和VHA-c3被Ca2＋促進(jìn)表達(dá)，而VHA-c5則被Ca2＋抑制表達(dá)，這說明VHA-c基因可被Ca2＋調(diào)控表達(dá)。盡管如此，顯著性檢驗(yàn)結(jié)果卻表明Ca2＋對(duì)VHA-c表達(dá)的調(diào)節(jié)作用并不顯著。

表1 Ca2＋處理下VHA-c-GUS表達(dá)水平的顯著性檢驗(yàn)

2.2 MS培養(yǎng)基對(duì)VHA-c-GUS基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

將轉(zhuǎn)VHA-c-GUS基因煙草葉片分別培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基和不含任何營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中，也發(fā)現(xiàn)其GUS表達(dá)水平的明顯差異（見表2）。從表2可見：VHA-c2、VHA-c3和VHA-c5均可被MS促進(jìn)表達(dá)，與無任何營養(yǎng)成分的培養(yǎng)條件相比，分別提高了2.39倍、2.58倍和8.50倍。這說明VHA-c基因的表達(dá)受MS營養(yǎng)的調(diào)節(jié)。

表2 MS培養(yǎng)基處理下VHA-c-GUS表達(dá)水平的顯著性檢驗(yàn)

3 討論

3.1 營養(yǎng)處理與GUS檢測本底

對(duì)野生型煙草葉片進(jìn)行Ca2＋和MS營養(yǎng)成分培養(yǎng)處理后，其GUS檢測本底如表3所示。研究結(jié)果表明：MS營養(yǎng)成分的有無對(duì)GUS本底的影響微小，而無Ca2＋條件下GUS本底卻顯著升高（見表3）。這與文獻(xiàn)［8］認(rèn)為的某些二價(jià)金屬離子能抑制GUS活性的觀點(diǎn)一致。然而，野生型煙草葉片中不存在GUS酶。而且無任何營養(yǎng)成分的培養(yǎng)處理也未能提高GUS的本底。推測這與離子強(qiáng)度不同引起的細(xì)胞內(nèi)容物的變化有關(guān)。

表3 Ca2＋和MS營養(yǎng)成分處理下GUS檢測本底的顯著性檢驗(yàn)

3.2 Ca2＋和MS營養(yǎng)成分對(duì)VHA-c基因表達(dá)的調(diào)節(jié)及其可能機(jī)制

試驗(yàn)結(jié)果表明：VHA-c2和VHA-c3可被Ca2＋促進(jìn)表達(dá)，而VHA-c5表達(dá)則被Ca2＋抑制。同時(shí)，MS營養(yǎng)成分可顯著促進(jìn)VHA-c2、VHA-c3和VHA-c5基因的表達(dá)。說明VHA-c基因可被Ca2＋和MS等營養(yǎng)成分調(diào)控表達(dá)。與文獻(xiàn)［9］認(rèn)為的擬南芥V-ATPase c亞基編碼基因的表達(dá)與營養(yǎng)成分有關(guān)的結(jié)果是一致的。然而，文獻(xiàn)［9］的研究結(jié)果認(rèn)為：低營養(yǎng)供應(yīng)促進(jìn)了擬南芥V-ATPase c亞基編碼基因mRNA的累積，這與本文無營養(yǎng)成分下VHA-c基因表達(dá)量顯著低于MS營養(yǎng)條件的結(jié)果正好相反。其原因可能主要有3點(diǎn)：首先，本文研究的是MS和無營養(yǎng)的2種較為極端的情況下的VHA-c基因的表達(dá)情況。而文獻(xiàn)［9］則研究的是1／2 MS和1／200 MS的培養(yǎng)條件。其次，本文研究的是擬南芥V-ATPase c亞基編碼基因的調(diào)控序列，而文獻(xiàn)［9］研究的是擬南芥V-ATPase c亞基編碼基因。另外，擬南芥V-ATPase c亞基是多基因編碼的基因家族，現(xiàn)已證實(shí)存在至少4種高度同源的編碼基因，文獻(xiàn)［9］研究的是其編碼基因的AVA-P1、AVA-P2和AVA-P3。本文研究的是VHA-c2、VHA-c3和VHA-c5。由此可見，有必要設(shè)置無MS和MS營養(yǎng)供應(yīng)的梯度試驗(yàn)。由此推測：VHA-c3可能被低營養(yǎng)促進(jìn)表達(dá)。

關(guān)于Ca2＋對(duì)VHA-c的作用機(jī)制，可能與Ca2＋／H＋反向傳遞體有關(guān)。已有大量的研究結(jié)果表明：植物液泡膜上存在Ca2＋／H＋反向傳遞體［10－11］。另外，目前的研究普遍認(rèn)為Ca2＋是一種信號(hào)物質(zhì)［12－13］，而pH也被認(rèn)為是植物逆境信號(hào)的一部分［14－17］，有研究表明：植物逆境的pH變化與質(zhì)子泵直接有關(guān)［17］，由此推測，Ca2＋對(duì)VHA-c的作用機(jī)制可能與信號(hào)系統(tǒng)有關(guān)。

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Q945.78

A

1672－6871（2014）05－0079－03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30460018）

張春霖（1978－），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，講師，碩士，研究方向?yàn)橹参锷锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)；王瑞剛（1972－），男，通信作者，內(nèi)蒙古赤峰人，教授，博士后，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锷锘瘜W(xué)與分子生物學(xué).

2013－03－22