諸葛小菊，陳仁聘，黃燮林，陳超，盧的一，黃智銘，吳金明，吳建勝

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 仁濟(jì)學(xué)院，浙江溫州 325035）

胃癌的發(fā)病率高居惡性腫瘤的前4位，其發(fā)病過程受到多基因、多因素的影響[1]。越來越多的證據(jù)表明抑癌基因的失活在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在胃癌癌變早期，抑癌基因的表觀遺傳學(xué)改變占有重要的地位，尤其是抑癌基因啟動子的異常甲基化[2]。

Lactotransferrin（LTF）基因位于人類染色體3p21.3區(qū)域，其在鼻咽癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤及相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞株呈現(xiàn)表達(dá)降低或缺失的狀態(tài)，有研究[3-6]顯示這與該基因啟動子區(qū)域的異常甲基化高度相關(guān)。5-Aza-2’-deoxycytidine（5-aza-CdR）能結(jié)合DNA甲基轉(zhuǎn)移酶I并使其失活，逆轉(zhuǎn)抑癌基因的高甲基化狀態(tài)，重新激活基因表達(dá)。而目前對于LTF基因在胃癌內(nèi)的研究尚少，因此本研究選擇胃癌細(xì)胞株BGC823，觀察LTF基因的表達(dá)和其啟動子甲基化狀態(tài)，旨在研究胃癌細(xì)胞株內(nèi)LTF基因表達(dá)水平和啟動子異常甲基化的相關(guān)性，為胃癌臨床診斷治療提供一個新的可能靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌細(xì)胞株BGC823購于中國上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；PRMI-1640、PBS、青/鏈霉素100 U/mL購于Gibco公司；5-aza-CdR（Sigma公司），用培養(yǎng)基充分溶解配成適量濃度的母液，分裝后存于-80 ℃?zhèn)溆?；TRIzol購于Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time PCR試劑盒（SYBR?Green Re altime PCR Master Mix）購于日本TOYOBO公司；亞硫酸氫鈉修飾試劑盒購于美國ZYMO公司；Ex Taq HS DNA聚合酶、pMD 19-T Vector購于日本TaKaRa公司；抗體anti-Lactoferrin購于美國Abcam公司（77 kDa，1:1 000#ab10110；Abcam，Cambridge，UK）；β-actin antibody購于中國碧云天（42 kDa，1:1 000，Beyotime，中國上海）。熒光定量PCR儀為BIO-RAD（型號CFX96）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和5-aza-CdR藥物處理：BGC82 3細(xì)胞用含10%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)液放置在37 ℃，5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以1×105均勻鋪入六孔板內(nèi)，生長過夜。饑餓處理16 h，然后給予0 μmol/L（對照組）、2 μmol/L、10 μmol/L的5-aza-CdR藥物處理，24 h換液一次，培養(yǎng)5 d后處理細(xì)胞。

1.2.2 real-time PCR檢測藥物干預(yù)前后LTF基因mRNA表達(dá)：取對照組和藥物處理組的回收細(xì)胞，用TRIzol提取細(xì)胞總RNA。約取1 μg總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反應(yīng)得到20 μL體系的cDNA。以得到cDNA為模板，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。引物由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成，用GAPDH作為內(nèi)參，引物序列分別為上游5’-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3’，下游5’-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度113 bp。LTF引物序列分別為：上游5’-TACAAATC CCAACAAAGCAGTG-3’，下游5’-CTTCCACAGGTCTATCC ACACA-3’，產(chǎn)物大小約58 bp。20 μL PCR體系包括：Realtime PCR Master Mix 10 μL，Plus solution 2 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）1.2 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）1.2 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)條件是95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s、62 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s進(jìn)行40個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束進(jìn)行熔解曲線分析來辨別是否有非特異性擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù) 用2-ΔΔCt法分析。

1.2.3 Western blot法檢測藥物干預(yù)前后LTF基因蛋白表達(dá)：回收對照組和藥物處理組細(xì)胞，加入適量的蛋白抽提cell lysis buffer（每孔50μg）裂解細(xì)胞，然后用BCA法測定蛋白質(zhì)的濃度。用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，將蛋白用半干式電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，用5%脫脂牛奶TBST封閉硝酸纖維膜，室溫下?lián)u2 h。與一抗anti-Lactoferrin（77 kDa）結(jié)合（以TBS稀釋，濃度依抗體而定），4 ℃搖過夜，TBST洗4次，每次5 min，用β-actin antibody（42 kDa）作為內(nèi)參。加入二抗（以TBS稀釋，濃度依抗體而定），室溫?fù)u1 h，TBST洗4次，每次5 min。用ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。X線片壓片、顯影、定影。

1.2.4 亞硫酸氫鹽修飾DNA和BSP反應(yīng)：取對照組和藥物處理組的回收細(xì)胞，按DNA提取試劑盒提取胃癌細(xì)胞株的基因組DNA。然后按甲基化修飾試劑盒進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，使未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶（T），而甲基化的Cm不變。以修飾后基因組DNA為模板，用Ex Taq HS DNA聚合酶進(jìn)行LTF基因啟動子擴(kuò)增。LTF特異性引物參考文獻(xiàn)[5]，分別是上游5’-TTGAGATTAGAGTTGGGATAGGG-3’，下游5’-CCCCCAAACACCTACACTCA-3’，產(chǎn)物長度為397 bp。其反應(yīng)體系為50 μL，包括：TaKaRa Taq HS 0.25 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1μL，模板DNA 1 μL（≤50 ng），ddH2O 37.75 μL。反應(yīng)條件為95 ℃變性15 min，94 ℃ 30 s、56℃ 30 s、72 ℃ 30 s進(jìn)行35次循環(huán)，然后72 ℃延伸7 min。將獲得的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 挑選陽性克隆和測序：于紫外燈下切取含目的DNA的條帶，按DNA凝膠回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。取回收純 化的DNA 4.5 μL，與pMD 19-T Vector 0.5 μL、solution I 5 μL配成10 μL體系，輕輕混勻后16 ℃連T載體12 h。取2.5 μL連接產(chǎn)物與25 μL的大腸桿菌感受態(tài)冰浴30 min，42 ℃水浴90 s，冰上放置3 min，加入不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基600 μL，37 ℃，250 r/min振搖45 min，離心將菌液濃縮為15 μL，并涂于氨芐（100 μg/mL）抗性的LB平板上，先正面向上放置平板1 h風(fēng)干，翻轉(zhuǎn)倒置平板37 ℃培養(yǎng)過夜，12～16 h后即可長出菌落。隨機(jī)挑選15個單克隆菌落，放在500 μL LB液體培養(yǎng)基（含有氨芐青霉素100 μg/mL），搖渾濁菌液。用普通PCR鑒定陽性重組子，取1 μL搖渾的菌液做PCR模板，2×Taq酶Mix 5 μL，上下游通用引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL構(gòu)成10 μL PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。最后送檢10個克隆于上海生工公司測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。real-time PCR結(jié)果和總體甲基化率組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。CpG位點(diǎn)甲基化率比較用行×列表卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞株BGC823 LTF基因的mRNA 表達(dá) 不同濃度5-aza-CdR處理胃癌細(xì)胞株BGC823后，藥物處理的兩組其mRNA表達(dá)較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但藥物處理組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果如圖1A所示。我們用Western blot方法檢測藥物干預(yù)前后LTF基因蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，對照組LTF表達(dá)低，兩個不同濃度的藥物組較對照組表達(dá)明顯增加。

圖2 5-aza-CdR藥物處理前后LTF的蛋白表達(dá)

2.2 胃癌細(xì)胞株BGC823藥物處理前后LTF基因甲基化情況 BSP結(jié)果電泳圖如圖3所示，目的條帶397 bp清晰。LTF基因連接T載體后挑選陽性克隆電泳結(jié)果如圖4所示，表明所選陽性單克隆概率高，達(dá)83.3%（5/6）。

圖3 LTF基因的BSP法電泳圖結(jié)果

圖4 LTF甲基化后目的DNA連T載體挑選陽性克隆電泳圖

BGC823被不同濃度5-aza-CdR處理后LTF其總體甲基化率統(tǒng)計(jì)見圖1B，其中對照組表明胃癌 細(xì)胞株BGC823明顯高甲基化，而藥物處理后的兩組啟動子甲基化情況被逆轉(zhuǎn)，且兩個藥物處理組和對照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（甲基化率對照組為53.6%，藥物濃度2μmol/L組為27.9%，濃度10μmol/L組為35.0%）（P＜0.05），但藥物處理組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LTF基因啟動子區(qū)14個CpG位點(diǎn)甲基化情況如圖5顯示，其中3、4、5、8、10、11、12、13、14號CpG位點(diǎn)甲基化程度超過50%，呈高甲基化狀態(tài)。而用5-aza-CdR處理后，與對照組相比，14號位點(diǎn)甲基化情況幾乎沒有變化，3、8這兩個CpG位點(diǎn)甲基化率較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

胃癌的發(fā)生機(jī)制是涉及多因素多步驟的一個過程，主要包括遺傳性因素和表觀遺傳學(xué)因素改變的堆積，而后者主要包括啟動子區(qū)甲基化、雜合性丟失、組蛋白修飾三方面。越來越多的研究表明DNA啟動子區(qū)甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中占有重要的地位。Lund等[7]認(rèn)為DNA甲基化在某種時候甚至超越基因缺失和基因突變，是抑癌基因失活的唯一機(jī)制。DNA甲基化是一可逆過程，5-aza-CdR作為一種甲基化轉(zhuǎn)移酶，可以成功逆轉(zhuǎn)DNA的甲基化程度，使得原先因甲基化而失活的基因能夠重新表達(dá)或表達(dá)增強(qiáng)，恢復(fù)正常的細(xì)胞調(diào)控功能。這提示去甲基化劑治療能夠逆轉(zhuǎn)基因的甲基化狀態(tài)，具有一定的應(yīng)用前景。

圖5 5-aza-CdR藥物處理前后LTF基因啟動子區(qū)14個CpG位點(diǎn)甲基化情況

研究發(fā)現(xiàn)人體染色體3p21.3區(qū)域存在一群高密度分布的腫瘤抑制基因簇（TSGs），該區(qū)域的抑癌基因在肺癌、乳腺癌、腎癌和其他腫瘤中常常表達(dá)缺失[8]。LTF基因，亦是其中重要一員，編碼乳鐵蛋白（lactoferrin，LF），其主要存在于哺乳動物的乳液、唾液、淚液、精液等外分泌物中，能參與體內(nèi)鐵代謝、抗菌、細(xì)胞生長和分化、免疫調(diào)節(jié)和抗炎癥反應(yīng)、抗氧化反應(yīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)[9-10]。近來研究發(fā)現(xiàn)，LF在抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡方面也有重要作用[11]。

Iijima等[5]報道LTF基因在59%（16/27）小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，77%（33/43）非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，54%（7/33）原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌內(nèi)表達(dá)缺失，且與DNA甲基化高度相關(guān)。研究[6]發(fā)現(xiàn)LTF基因mRNA在74%前列腺癌患者中呈低表達(dá)，而且LTF相對高表達(dá)的前列腺癌患者有更好的預(yù)后，這反映LTF在前列腺癌患者中有保護(hù)性的功能。DNA去甲基化劑地西他濱（decitabine）能使LTF基因在前列腺癌細(xì)胞株LAPC4中被強(qiáng)激活表達(dá)。LTF基因在多種腫瘤內(nèi)表現(xiàn)為一種有潛力的抑癌基因，其失活機(jī)制和DNA啟動子區(qū)高度甲基化相關(guān)。本研究觀察藥物處理組和對照組發(fā)現(xiàn)，隨著藥物處理組DNA甲基化率的下降，其LTF mRNA表達(dá)增加，這說明LTF基因在胃癌里的表達(dá)是可以被逆轉(zhuǎn)的，而且其機(jī)制和DNA甲基化高度相關(guān)。但是兩個藥物處理組間的甲基化率和mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能和5-aza-CdR對BGC823的去甲基化作用達(dá)到平臺期相關(guān)。重亞硫酸鹽修飾DNA測序法，是公認(rèn)的DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究用該方法檢測發(fā)現(xiàn)，低分化型胃癌細(xì)胞株BGC823啟動子區(qū)甲基化程度高達(dá)53.6%，該段DNA啟動子區(qū)含有14個CpG島，CpG島是一段長約1 kb的富含飾CpG和GpC序列的DNA結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)3、4、5、8、10、11、12、13、14號CpG位點(diǎn)甲基化程度超過50%，呈高甲基化狀態(tài)，而用5-aza-CdR處理后，14號位點(diǎn)甲基化率幾乎沒有變化，而3、8這兩個CpG位點(diǎn)甲基化率較對照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），猜測這兩個位點(diǎn)和LTF基因在胃癌中的表達(dá)缺失及逆轉(zhuǎn)其表達(dá)可能相關(guān)。

大量研究證明LF在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中有抗腫瘤作用[12-14]，但是其機(jī)制目前并不明確。LF能以影響細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，Zhang等[4]用LTF轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株后，發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞停滯在G1期，而S期、G2-M期細(xì)胞減少。有研究[15]認(rèn)為LF能以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和抑癌基因（p53和Rb）的表達(dá)來影響細(xì)胞周期的整個進(jìn)程。但是亦有報道持不同意見，認(rèn)為LF補(bǔ)給治療能調(diào)節(jié)MAPK（mitogenactivated protein kinase）通路卻不會影響p53的表達(dá)[14]。體外實(shí)驗(yàn)證明注射LF能抑制小鼠體內(nèi)移植實(shí)體瘤的大小，F(xiàn)ujita等[16]發(fā)現(xiàn)LF在小鼠結(jié)腸癌發(fā)展過程中，激活Fas信號通路導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。當(dāng)然，對于LTF基因在胃癌內(nèi)的抑癌機(jī)制是否涉及以上幾種，需更多的實(shí)驗(yàn)研究。

DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)重要機(jī)制之一，其本身優(yōu)勢在于不涉及基因序列的改變就可以調(diào)控基因的表達(dá)，并且能夠被甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑逆轉(zhuǎn)。5-aza-CdR，作為一種甲基化轉(zhuǎn)移酶，已成功應(yīng)用于白血病的臨床治療[17]，這對抑癌基因甲基化異常相關(guān)的腫瘤來說是個成功的例子。針對LTF基因在胃癌內(nèi)表達(dá)和基因甲基化機(jī)制的關(guān)聯(lián)，提示我們未來可能通過甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑來進(jìn)行腫瘤的預(yù)防和早期治療，當(dāng)然這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)及臨床研究。

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