馮 燕，朱珊麗，林曉云，薛向陽，李文姝，張麗芳

（溫州醫(yī)科大學微生物學與免疫學教研室，浙江溫州325035）

沙眼衣原體（Chlamydiatrachomatis，Ct）型別眾多，感染十分普遍，不僅是引起沙眼、致盲的主要原因，還可通過性接觸途徑引起男性尿道炎和女性宮頸炎[1]，因此也是性傳播感染（sexuallytransmittedinfections，STIs）的主要病原之一。Ct感染可導致不良妊娠，如異位妊娠、流產(chǎn)等[2]，且經(jīng)抗生素治療后極易復發(fā)。Ct在細胞內(nèi)完成獨特的雙相發(fā)育周期，即具有代謝惰性的感染性原體（elementarybody，EB）和代謝活躍的非感染性網(wǎng)狀體（reticulatebody，RB）。發(fā)育周期完成后，EB從細胞中釋放并感染鄰近的細胞，從而形成循環(huán)增殖[3]。

原體和許多其他革蘭陰性病原菌一樣，通過III型分泌系統(tǒng)（typeIIIsecretionsystem，T3SS）分泌的多種毒力蛋白，即效應蛋白是其主要的致病因素[4]。近年來，學者發(fā)現(xiàn)衣原體T3SS的效應蛋白之一—Tarp蛋白，該蛋白在衣原體EB黏附宿主細胞時能誘導EB進入細胞[5]，故認為該蛋白可能作為衣原體的受體參與EB的黏附入侵。同時用該蛋白免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其能刺激小鼠產(chǎn)生較高滴度的特異性抗體和細胞免疫，而且能顯著降低Ct引起小鼠生殖道感染的炎癥程度[6]，故該蛋白可作為預防和治療Ct感染的候選疫苗之一。但由于該蛋白分子質(zhì)量較大（約100kDa），表達制備并保持蛋白的天然構象較為困難，故選擇其表位作為研究對象。表位是抗原分子中可與T細胞和B細胞表面受體結合，誘導特異性細胞免疫和體液免疫，從而產(chǎn)生免疫保護作用的一段氨基酸序列。

本研究擬以生殖道感染最常見的E型Ct的Tarp蛋白為基礎，利用生物信息學綜合分析預測Tarp蛋白的B細胞表位，將預測獲得的B細胞表位多肽經(jīng)人工合成后免疫小鼠，進一步檢測其刺激機體產(chǎn)生抗體的能力及抗體與天然Tarp蛋白的結合能力。具有免疫原性和抗原性的B細胞表位的篩選和鑒定，為進一步研究Tarp蛋白的生物學特性及表位疫苗研制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑CtE血清Ct標準菌株購自美國典型物保藏中心（ATCC：VR-348B）；HeLa229細胞由本實驗室保存；RPMI-1640培養(yǎng)液購自Hyclone公司；胎牛血清（FCS）購自杭州四季青公司；HRP-羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、FITC-羊抗鼠IgG抗體和FITC-羊抗兔IgG抗體均購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司；兔抗Ct血清多抗為本室制備[7]；碘化丙碇（PI）購自Solarbio公司；IP細胞裂解液和ProteinGAgarose購自碧云天生物技術研究所；表位多肽合成委托上海波泰生物科技有限公司。

1.2 E血清型CtTarp蛋白B細胞表位預測根據(jù)瑞士生物信息研究所提供的SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫得到E血清型CtTarp蛋白氨基酸序列。根據(jù)文獻[8]提供的方法，即應用EXPASY服務器（http://www.expasy.ch/tools）上的GOR預測Tarp的二級結構；采用Hopp-Woods親水性參數(shù)、Janin可及性參數(shù)、柔韌性參數(shù)預測（http://expasy.org/cgibin/protscale.p1）、Emini表面可能性，并按Jameson-Wolf方案預測蛋白的抗原性。將上述方法互相參照，綜合分析比較，兼顧各項預測參數(shù)推斷CtTarp蛋白B細胞識別的潛在位點。

1.3 BALB/c小鼠免疫采用氨基酸合成法合成篩選表位肽段，純度為85%，用無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋為4mg/mL。將6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為8組，每組3只。首先將各表位肽與KLH經(jīng)戊二醛偶聯(lián)，取含100μg表位合成肽的偶聯(lián)物與完全弗氏佐劑等體積充分乳化后，采用背部皮下多點注射途徑免疫小鼠，同時設置PBS對照組。隔周進行，共免疫3次，2次的加強免疫多肽與不完全弗氏佐劑充分乳化。分別于第2、第4、第6周收集血清，分裝后置-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫小鼠血清抗體IgG及其亞類的檢測以20μg/mL的B細胞表位合成肽包被96孔酶標板，3%牛血清白蛋白（BSA）-PBST封閉，加入稀釋的免疫小鼠血清樣品，37℃反應1h，PBST洗滌后，分別加入1:2000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a100μL，37℃反應1h，洗滌后經(jīng)四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色，加入2mol/LH2SO4終止反應。反應結果置BioElx800酶標儀于450nm波長處讀取A值。每份血清標本均重復3孔檢測。

1.5 陰道分泌物sIgA抗體的檢測用無菌PBS緩沖液取小鼠陰道分泌物，每只小鼠采集200μL樣品，置-80℃保存?zhèn)溆谩LISA法檢測陰道分泌物sIgA抗體步驟同上，不同的是，二抗為HRP-羊抗鼠sIgA。

1.6 免疫沉淀實驗及Westernblot法檢測血清抗體與Tarp蛋白的結合能力E血清型Ct感染HeLa229細胞48h后，裂解液充分裂解HeLa229細胞，提取蛋白，與合成肽免疫血清4℃孵育過夜，再與ProteinGAgarose4℃孵育3h，2500r/min離心5min后，棄上清，獲取沉淀物，用預冷PBS洗滌沉淀，2500r/min離心5min，獲取洗滌后沉淀物。以SDS-PAGE分離沉淀后，轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉后與合成肽免疫血清孵育2h，洗滌后與HRP-羊抗鼠IgG作用1h，TBST漂洗3次，ECL顯影，壓片。同時用未感染Ct的HeLa229細胞作為陰性對照進行免疫沉淀實驗和Westernblot法檢測。

1.7 間接免疫熒光實驗檢測血清抗體與天然Tarp抗原的結合能力E血清型Ct感染HeLa229細胞48h后，2%多聚甲醛固定10min，用含0.3%TritonX-100的PBS透膜10min，洗滌后采用10%FCS-RPMI-1640室溫封閉1h，加入稀釋的合成肽免疫血清，同時設置陽性對照（兔抗Ct血清多抗）及陰性對照鼠抗PBS、鼠抗KLH血清抗體，與感染的細胞37℃孵育1h，PBS洗滌后，分別加入含F(xiàn)ITC-羊抗鼠IgG、PI的二抗混合液和FITC標記的羊抗兔IgG、PI的二抗混合液，37℃孵育1h，封片后采用激光共聚焦顯微鏡（LeicaTCSSP2）觀察。

1.8 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)以表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間均數(shù)比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Tarp蛋白B細胞表位的預測蛋白共有957個氨基酸，相對分子質(zhì)量約為100kDa。通過生物信息學技術，預測Tarp蛋白的二級結構、親水性（見圖1A）、柔韌性（見圖1B）、極性（見圖1C）、表面可能性（見圖1D）、抗原性（見圖1E）等結果，兼顧各預測參數(shù)綜合分析比較，推斷CtTarp蛋白B細胞表位，共得到6個潛在的B細胞表位，其氨基酸序列分別為：（F1）aa80-95（TSSSSTQATATSNKTS）；（F2）aa107-123（TSESSETSSTSSSDHIP）；（F3）aa152-170（SNYDDAAADYEPIRTTENI）；（F4）aa171-186（YESIGGSRTSGPENTS）；（F5）aa239-253（VAAAALNSLRGSSY）和（F6）aa497-513（NTTNTTPTTQSTDASTD）。

圖1 Tarp蛋白的各預測參數(shù)

2.2 血清特異性IgG抗體及其亞類產(chǎn)生情況合成肽包被聚乙烯微量反應板后采用ELISA法檢測，結果顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，F(xiàn)3和F4合成肽組血清特異性IgG抗體水平呈明顯上升趨勢。免疫后第4周，F(xiàn)3合成肽組血清（0.396±0.036）和F4合成肽組血清（0.267±0.04）特異性IgG抗體水平與其他組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=20.928，P＜0.05），同時，免疫后第6周，F(xiàn)3和F4合成肽組血清特異性IgG抗體水平與其他組比較，均值分別為0.572±0.040、0.619±0.053，差異有統(tǒng)計學意義（F=46.656，P＜0.05），見圖2A；而F3組和F4組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。末次免疫后2周檢測小鼠血清中IgG亞類水平，F(xiàn)3和F4合成肽組血清特異性IgG1抗體與其他組比較，均值分別為0.351±0.059、0.244±0.032，差異有統(tǒng)計學意義（F=24.427，P＜0.05），并且F3和F4兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=9.103，P＜0.05），見圖2B；同時檢測IgG2a亞類的產(chǎn)生水平，各組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對比IgG2a和IgG1抗體水平，F(xiàn)3和F4組多肽誘導的抗體以IgG1類型為主，即其誘導的免疫類型傾向于Th2型。

圖2 不同免疫組小鼠血清特異性抗體IgG及其亞類IgG1和IgG2a的產(chǎn)生情況

2.3 陰道分泌物特異性sIgA抗體產(chǎn)生情況合成肽包被聚乙烯微量反應板后采用ELISA法檢測，結果顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，F(xiàn)4合成肽組小鼠陰道分泌物中特異性sIgA抗體水平呈明顯上升趨勢。免疫后第6周，F(xiàn)4組小鼠陰道分泌物中特異性sIgA抗體水平為0.503±0.048，與其余組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=39.213，P＜0.05），見圖3。由于F4組多肽既能刺激機體產(chǎn)生血清抗體IgG和陰道分泌物抗體sIgA，故后續(xù)實驗主要檢測F4組多肽誘導的免疫血清。

2.4 Westernblot法檢測血清抗體與Tarp蛋白的結合能力Ct感染HeLa229細胞48h后，使用細胞裂解液裂解細胞并提取蛋白，與F4多肽末次免疫后免疫小鼠血清抗體及ProteinGAgarose共沉淀，沉淀物經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)PVDF膜進行Westrenblot法分析，結果（見圖4）顯示，F(xiàn)4多肽免疫組血清沉淀后除了分別在55kDa和22kDa處出現(xiàn)IgG的重鏈和輕鏈，且在相對分子質(zhì)量（Mr）大小為105kDa處出現(xiàn)了一條明顯的條帶，與預期Tarp蛋白大小相符。而陰性對照（未感染Ct的HeLa229細胞）小鼠血清沉淀后只在相應位置出現(xiàn)IgG的重鏈和輕鏈。結果提示，F(xiàn)4組免疫血清抗體可與天然Tarp蛋白結合。

圖3 不同免疫組小鼠陰道分泌物中特異性抗體sIgA的產(chǎn)生情況

圖4 免疫沉淀實驗及Westernblot法檢測多肽免疫血清與Tarp蛋白的結合

2.5 間接免疫熒光實驗檢測血清抗體與Tarp蛋白的結合以抗F4多肽免疫血清為一抗，經(jīng)間接免疫熒光實驗檢測其與天然Tarp蛋白的結合能力。結果（見圖5）顯示，細胞核經(jīng)PI免疫熒光染色后呈紅色熒光，F(xiàn)4血清抗體組細胞質(zhì)中呈現(xiàn)綠色熒光，同時陽性對照組（Ct免疫兔血清）細胞質(zhì)中也有綠色熒光呈現(xiàn)，而陰性對照組（PBS、KLH免疫組血清）均無綠色熒光顯示。結果提示F4組免疫血清抗體可與天然Tarp蛋白高效結合。

3 討論

圖5 間接免疫熒光實驗檢測表位免疫血清與Tarp蛋白的結合（×400）

目前，Ct致病機制仍不清楚。雖有大量關于衣原體的疫苗研究，但至今尚無成熟疫苗問世。近年來研究發(fā)現(xiàn)，T3SS的效應蛋白之一Tarp蛋白，已成為Ct感染后疾病免疫預防研究的新靶點[9]。Tarp蛋白預存于T3SS的注射裝置，該蛋白在衣原體EB黏附宿主細胞時能快速磷酸化，并誘導EB進入細胞，故認為該蛋白在衣原體感染宿主細胞的第一步─黏附過程中起到重要作用。同時Tarp蛋白有較強的免疫原性，有學者用該蛋白免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其能刺激小鼠產(chǎn)生較高滴度的特異性抗體和細胞免疫，而且能顯著降低Ct引起小鼠生殖道感染的炎癥程度[6]。故該蛋白可作為預防和治療Ct感染的候選疫苗之一。

考慮到Tarp蛋白相對分子質(zhì)量較大（約100kDa），表達制備并保持該蛋白的天然構象較為困難，故選擇其表位作為研究對象。表位能誘導特異性免疫應答，同時可避免與特異性免疫無關成分導致的病理免疫應答，可誘導更強、更特異的免疫效應，是目前感染性疾病和惡性腫瘤疫苗的研究熱點[10-11]，因而CtTarp蛋白的表位研究引起了研究人員的重視。

Ct有19個血清型別，其中D、E、F、G和H等血清型主要引起泌尿生殖道感染，而其中E型則是國內(nèi)外報道[12-13]中最為常見的型別。因此，本研究以E血清型CtTarp蛋白為基礎，通過生物信息學技術分析，初步預測得到該蛋白的6個潛在的B細胞表位。Ct主要通過黏膜接觸途徑傳播，血清中的特異性抗體IgG和陰道分泌物中抗體sIgA在保護生殖道Ct感染中起到非常重要的作用[14]。筆者將初步得到的6個潛在B細胞表位多肽經(jīng)人工合成后免疫BALB/c小鼠，其中F3、F4多肽免疫組可在血清中檢測到較高水平的特異性抗體IgG，并以IgG1亞類為主，表明免疫應答主要趨于Th2型，進一步說明這兩段氨基酸為Tarp蛋白的B細胞免疫優(yōu)勢區(qū)。同時，F(xiàn)4多肽免疫組可在陰道分泌物中檢測到顯著高水平的特異性抗體sIgA，而F3多肽免疫組僅檢測到較低水平特異性sIgA抗體，其原因可能與抗原的特性、機體對免疫原的敏感性[15]以及與免疫的途徑[16-17]相關，因此筆者的后續(xù)實驗主要檢測F4組多肽誘導的免疫血清。

為進一步鑒定預測所得B細胞表位的抗原性，筆者通過免疫沉淀實驗、Westernblot法和間接免疫熒光實驗等方法檢測了F4多肽免疫組血清與天然Tarp抗原的結合能力。免疫沉淀實驗和Westernblot法檢測結果顯示，在相對分子質(zhì)量約105kDa處檢測到一條帶，說明F4多肽免疫組血清可與感染了Ct的HeLa229細胞結合（表達天然Tarp蛋白），從而證實預測所得F4表位具有較強的抗原性。同時，Westernblot法檢測結果中，在IgG輕鏈的上方可看到兩條非特異性條帶，說明該蛋白也可與F4多肽免疫血清結合，考慮為大分子量目的蛋白Tarp的降解產(chǎn)物。間接免疫熒光實驗結果也顯示F4多肽免疫組血清可與感染了Ct的HeLa229細胞結合（表達天然Tarp蛋白），從而進一步證實預測所得F4表位具有較強的抗原性。

本實驗通過生物信息學分析初步預測并鑒定出Tarp蛋白的一個B細胞優(yōu)勢表位（aa171-186），其可誘導BALB/c小鼠產(chǎn)生血清中特異性以IgG1為主的體液免疫，且免疫血清可與天然Tarp蛋白結合，具有較強的免疫原性和抗原性。其免疫小鼠血清抗體的中和活性及對Ct動物感染模型的免疫保護作用研究正在進行中。