周林杰，鄭貞蒼，王鑫，陳鵬

（恩澤醫(yī)療中心路橋醫(yī)院 重癥監(jiān)護室，浙江 臺州 318050）

人類白細胞抗原-G（human leukocyte antigen-G，HLA-G）是機體內(nèi)一個重要的免疫耐受分子，屬于非經(jīng)典HLA I分子。在正常情況下，HLA-G分子表達具有組織特異性，僅在絨毛外滋養(yǎng)層細胞、角膜細胞等少數(shù)免疫豁免組織上表達。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)HLA-G分子在多種病理條件下（如病毒、炎癥、腫瘤、自身免疫病等）能夠獲得誘導(dǎo)性表達，并發(fā)揮重要的免疫逃逸功能[1]。一方面，HLAG能夠與免疫細胞上表達的受體結(jié)合，直接抑制如自然殺傷細胞、T淋巴細胞的殺傷活性；另一方面，HLA-G能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生具有免疫抑制活性的調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）等，間接發(fā)揮免疫抑制功能[2]。近來有研究表明，羊膜內(nèi)感染或組織絨毛膜羊膜炎的早產(chǎn)或正常分娩孕婦羊水中可溶性HLA-G（soluble HLA-G，sHLA-G）分泌水平要高于正常孕婦羊水sHLA-G的表達，推測sHLA-G可能在宿主抗羊膜炎癥反應(yīng)的過程中發(fā)揮重要的作用[3]。此外，在肌炎患者炎癥部位的骨骼肌中或急性神經(jīng)炎癥患者腦脊髓液中均發(fā)現(xiàn)HLA-G+T淋巴細胞的存在，且比例較高，表明HLA-G在機體內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要的功能[4]。本研究通過檢測54例乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染患者及63例正常獻血員外周血HBV的載量及sHLA-G的含量；將不同載量的HBV體外刺激單核細胞，采用RT-PCR、Western blot和流式細胞術(shù)檢測HLA-G抗原的誘導(dǎo)表達情況，旨在探討HBV誘導(dǎo)單核細胞HLA-G的表達及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 一般資料 收集2011年3月-9月在本院住院治療的HBV感染患者54例，其中男30例，女24例，年齡20～72歲，平均（46.5±21.6）歲。所有患者血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）/谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）持續(xù)或間歇升高，黃疸及凝血酶原時間均提示患者處于免疫清除期。住院前未口服過抗病毒藥物或免疫調(diào)節(jié)藥物，住院后馬上抽血保存于-20 ℃冰箱內(nèi)。經(jīng)乙肝三系檢測為HBV感染患者，且乙肝三系定量檢測乙肝表面抗原普遍大于250 IU/mL、乙肝e抗原為0.3～1 431 S/CO。臺州市血站提供2012年3月-6月的乙肝三系、肝功能與轉(zhuǎn)氨酶均正常的獻血員63例作為對照，其中男33例，女30例，年齡23～45歲，平均（34.2±9.1）歲。

1.2 方法

1.2.1 HBV載量測定：采用實時RT-PCR的方法測定54例HBV感染患者和63例正常獻血員外周血HBV的載量。HBV核酸擴增熒光定量檢測試劑盒購自申友生物，血清病毒載量低于1 000拷貝/mL將不能被檢測，實驗操作及分析嚴格按照說明書執(zhí)行。

1.2.2 血漿sHLA-G檢測：采用ELISA法檢測HBV感染患者血漿sHLA-G的含量。sHLA-G試劑盒購自biovendor公司（RD194070100R）。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及病毒感染：單核細胞株THP-1細胞和含HBV的人肝細胞DCX細胞購自中科院上海研究所。大量培養(yǎng)DCX細胞，收集約1×108個細胞，置于凍存管中，反復(fù)凍融細胞，采用病毒核酸抽提試劑盒無菌抽提HBV，經(jīng)實時PCR檢測HBV載量，調(diào)整載量為1×108拷貝/mL、1×107拷貝/mL、1×106拷貝/mL、1×105拷貝/mL、1×104拷貝/mL及PBS分別與THP-1細胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別為1、2、3、4、5、6 d。收集處理后的細胞，分別經(jīng)RT-PCR、Western Blot和流式細胞術(shù)檢測HLA-G誘導(dǎo)表達情況。

1.2.4 采用RT-PCR技術(shù)檢測經(jīng)HBV誘導(dǎo)后的單核細胞HLA-G異構(gòu)體轉(zhuǎn)錄情況：收集上述處理后細胞，抽提總RNA，按Fermentas公司反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書操作，合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，分別應(yīng)用HLA-G1～G6和pan HLA-G引物進行PCR擴增（引物序列見表1），條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s及68 ℃ 1 min，共40個循環(huán)，最后于72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

表1 RT-PCR擴增HLA-G異構(gòu)體mRNA的引物序列

1.2.5 采用Western blot法檢測經(jīng)HBV誘導(dǎo)單核細胞胞內(nèi)HLA-G表達情況：取上述細胞制備細胞裂解液，分別取10μL作SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)膜后，用1% BSA室溫封閉過夜。加入HLA-G特異性抗體4H84（1:1 000），4 ℃過夜。0.1% PBST洗滌3次，加入HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，室溫孵育30 min，0.1%PBST洗滌3次，加入底物顯色。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。HBV感染患者sHLA-G濃度用±s表示，組間比較采用t檢驗，若兩組數(shù)據(jù)方差不齊，則采用Satterthwaite近似t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV載量 HBV感染患者HBV載量均大于1×104拷貝/mL，而正常獻血員則小于100拷貝/mL。

2.2 外周血sHLA-G表達水平 HBV感染患者血漿sHLA-G表達水平為（118.127±60.325）U/mL，而正常獻血員為（8.484±5.129）U/mL，HBV感染患者血漿sHLA-G表達水平顯著高于正常獻血員，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，95%CI：88.5～130.74）。2.3 HBV誘導(dǎo)HLA-G基因轉(zhuǎn)錄增強及誘導(dǎo)HLA-G蛋白表達 將1×108拷貝/mL、1×107拷貝/mL、1×106拷貝/mL、1×105拷貝/mL、1×104拷貝/mL的HBV及PBS分別與THP-1細胞共培養(yǎng)24 h，結(jié)果表明，HBV載量為1×107拷貝/mL和1×108拷貝/mL誘導(dǎo)HLA-G1異構(gòu)體轉(zhuǎn)錄增強。采用1×108拷貝/mL HBV載量與THP-1細胞分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 d，結(jié)果表明，在HLA-G1轉(zhuǎn)錄及蛋白表達在第4天達到最高（見圖1-2）。此外，研究發(fā)現(xiàn)HBV誘導(dǎo)前后THP-1細胞均未轉(zhuǎn)錄HLA-G5 mRNA異構(gòu)體。

圖1 RT-PCR技術(shù)檢測HBV誘導(dǎo)THP-1細胞HLA-G1～G6和pan HLA-G表達情況

圖2 Western blot技術(shù)檢測HBV誘導(dǎo)THP-1細胞HLA-G蛋白表達情況

3 討論

HLA-G是機體內(nèi)一個重要的免疫耐受分子，炎癥、病毒感染后均可誘導(dǎo)HLA-G分子的表達，促進炎癥和病毒的免疫逃逸[5-6]。在此次研究中發(fā)現(xiàn)，HBV感染患者血漿sHLA-G抗原表達水平顯著高于正常獻血員（P＜0.01），表明sHLA-G可能是HBV感染的潛在有效標志物之一。

到目前為止，HBV感染患者未能完全清除體內(nèi)病毒，與HBV通過多種機制破壞機體免疫平衡系統(tǒng)相關(guān)。而誘導(dǎo)HLA-G表達從而抑制樹突狀細胞、自然殺傷細胞、病毒特異性CD4+和CD8+T淋巴細胞等是HBV逃避機體免疫攻擊的有效機制之一。研究發(fā)現(xiàn)，干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、白細胞介素-2、白細胞介素-10、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、白細胞抑制因子、激素（黃體酮、糖皮質(zhì)激素等）等均能誘導(dǎo)HLA-G的表達和增加sHLA-G的分泌[7-9]。HBV感染患者血漿sHLA-G分泌水平較正常人顯著升高，其誘導(dǎo)sHLA-G分泌機制還需進一步研究。因此，我們將HBV與THP-1細胞共同培養(yǎng)，結(jié)果表明，HBV載量為1×107拷貝/mL和1×108拷貝/mL誘導(dǎo)HLAG1異構(gòu)體轉(zhuǎn)錄增強。采用1×108拷貝/mL HBV載量與THP-1細胞分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 d，結(jié)果表明，在HLA-G1轉(zhuǎn)錄及蛋白表達在第4天達到最高。本研究初步發(fā)現(xiàn)，HBV通過體外感染THP-1細胞誘導(dǎo)sHLA-G分泌，而非通過細胞因子或激素等誘導(dǎo)。此外，HBV誘導(dǎo)HLA-G表達機制還需進一步研究。

Rebmann等[10]研究表明，血漿sHLA-G可能是HLA-G5或者是脫落的HLA-G1。本研究的sHLA-G ELISA試劑盒是用MEM-G/9包被而成，既能識別脫落的HLA-G1，也能識別HLA-G5，兩種含有β2-微球蛋白。在此次研究中，HBV誘導(dǎo)前后THP-1細胞均未轉(zhuǎn)錄HLA-G5 mRNA異構(gòu)體，提示HBV感染患者分泌的sHLAG可能是脫落的HLA-G1抗原。通過本次研究表明，HBV感染患者sHLA-G分泌水平顯著高于正常獻血員，而其機制可能是HBV增強單核細胞HLA-G基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)單核細胞表達HLA-G蛋白，從而使HLA-G參與調(diào)節(jié)HBV免疫逃逸。

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