(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰安醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東 泰安271000)

多藥耐藥往往是許多白血病患者化療失敗的主要原因之一。多藥耐藥的機(jī)制較為復(fù)雜，其中多藥耐藥基因mdr1及其編碼的P-糖蛋白(P-glycoprotin,P-gp)的過度表達(dá)、以及bcl-2等的過度表達(dá)是較公認(rèn)的產(chǎn)生MDR(多藥耐藥)的機(jī)制[1]。本研究觀察經(jīng)甲孕酮作用后的K562/AO2 細(xì)胞的凋亡，以及細(xì)胞內(nèi)P-gp、Bcl-2表達(dá)的變化，探討甲孕酮耐藥逆轉(zhuǎn)的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系 K562、耐藥K562/AO2細(xì)胞株(ADM誘導(dǎo)產(chǎn)生)購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液病研究所, 常規(guī)培養(yǎng)，置37 ℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境，培養(yǎng)液為含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640, 每2～3天換1次培養(yǎng)液。

1.2藥物和試劑 阿霉素(ADM，浙江海正藥業(yè))，醋酸甲孕酮(MPA,中國藥品生物制品檢定所)，流式細(xì)胞儀(FACS Calibur， BD公司)，小牛血清購自杭州四季青生物工程公司，二甲基亞砜(DMSO,北京化工廠),四甲基偶氮唑蘭(MTT，Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞培養(yǎng)方法 實(shí)驗(yàn)分對照組(K562/AO2細(xì)胞只加培養(yǎng)基不加藥物)，甲孕酮組(又分為1×10-6～ 1×10-4mol/L 3個(gè)不同的濃度組)、阿霉素組、甲孕酮聯(lián)合阿霉素組。取對數(shù)生長的K562/AO2細(xì)胞, 1×106/孔，接種到96孔培養(yǎng)板中, 設(shè)置ADM濃度10 μg/ml為工作濃度，阿霉素組加入濃度為10 μg /ml的阿霉素，甲孕酮組分別加入不同濃度的甲孕酮，甲孕酮聯(lián)合阿霉素組分別加入不同濃度的甲孕酮聯(lián)合濃度為10 μg /ml的阿霉素予以處理, 對照組只加等體積的培養(yǎng)基不加藥物，每孔設(shè)9個(gè)平行孔。加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.2MTT 法測定細(xì)胞抑制率 藥物作用K562/AO2細(xì)胞48 h后，分對照組、阿霉素組、甲孕酮1×10-6mol/L +阿霉素組、甲孕酮1×10-5mol/L +阿霉素組和甲孕酮1×10-4mol/L +阿霉素組，每組取3個(gè)平行孔，加入MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后水平離心,加入150 μl DMSO,應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀,選490 nm為測定波長,測定OD值, 取3孔平均值計(jì)算K562/AO2細(xì)胞增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率=(對照組OD均值-實(shí)驗(yàn)組OD均值) /對照組OD均值×100%

1．3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測耐藥細(xì)胞的凋亡百分率 藥物作用K562/AO2細(xì)胞48 h后，每組取3個(gè)平行孔，PBS處理，70%乙醇固定(4 ℃) 24 h，加100 μl PI染液后，在避光室溫條件下孵育30 min,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度(激發(fā)488 nm，發(fā)射670 nm波長)，用Multicycle軟件分析得出相應(yīng)的細(xì)胞凋亡百分率。

1.3.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞Bcl- 2表達(dá) 藥物作用48 h后, 分對照組(只加培養(yǎng)基)和甲孕酮組(分為1×10-6～ 1×10-4mol/L 3個(gè)不同的濃度組)及K562細(xì)胞組，每組樣本3個(gè)復(fù)孔，用PBS洗滌 2 次，加入 100 μl破 膜 劑 、 10 μlBcl- 2/FITC 以及相應(yīng)的陰性對照Mouse IgG1/FITC, 避光反應(yīng)30 min后,流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)反復(fù)3次。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞P-gp表達(dá)變化 實(shí)驗(yàn)分對照組(只加培養(yǎng)基)和甲孕酮組(分為1×10-6～ 1×10-4mol/L 3個(gè)不同的濃度組)及K562細(xì)胞組，藥物作用48 h后，收集細(xì)胞，75%乙醇固定30分鐘后，離心，PBS洗2次分兩管，均重懸于150μl PBS中，分別加入陰性對照液20 μl和P-gp單克隆抗體20 μl，用PBS調(diào)至1 ml，室溫孵育30 min，上機(jī)檢測。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞的抑制率 單純阿霉素組對K562 /AO2細(xì)胞系有一定的抑制作用;不同濃度的甲孕酮+阿霉素組的細(xì)胞抑制率均顯著高于單純阿霉素組(P<0.01);不同濃度的甲孕酮+阿霉素組之間細(xì)胞的抑制率有顯著性差異(P<0.01)。隨著甲孕酮藥物濃度增加，細(xì)胞抑制率呈上升趨勢。(表1)。

表1 對 K562/AO2的抑制率 、凋亡率

﹡與阿霉素組比較P<0.01；#與對照組組比較P<0.01。

2.2細(xì)胞的凋亡率 藥物作用48 h后檢測細(xì)胞凋亡率，甲孕酮聯(lián)合阿霉素組K562/AO2細(xì)胞凋亡率較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；單純阿霉素組與對照組相比細(xì)胞凋亡率略升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨著甲孕酮濃度的增加，細(xì)胞凋亡率均表現(xiàn)增高，見表1。

2.3Bcl-2的表達(dá)率 檢測K562敏感細(xì)胞的Bcl-2為低表達(dá)， K562 /AO2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的表達(dá)率明顯高，甲孕酮組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)率明顯下調(diào);不同濃度甲孕酮組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)率分別與對照組相比,均有顯著差異(P<0. 05)。(表2)。

表2 對K562/AO2細(xì)胞Bcl-2表達(dá)率的影響

注：與對照組比較，※P<0.05。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞P-gp的表達(dá)變化 敏感細(xì)胞K562的P-gp為低表達(dá)，檢測K562 /AO2細(xì)胞內(nèi)P-gp的表達(dá)率顯示:甲孕酮組細(xì)胞P-gp表達(dá)率明顯下調(diào);不同濃度的甲孕酮組與對照組相比均有顯著差異(P<0.05);不同濃度甲孕酮組細(xì)胞P-gp表達(dá)率分別與對照組相比,均有顯著差異(P<0. 05)。(表3)。

表3 對K562/AO2細(xì)胞P-gp表達(dá)率的影響

注：與對照組比較，﹡P<0.05。

3 討 論

臨床治療中導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因之一往往是腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，而導(dǎo)致多藥耐藥的機(jī)制比較復(fù)雜，其中包括抑凋亡基因的過度表達(dá)、多藥耐藥基因及其編碼的耐藥蛋白的過度表達(dá)等[2,3]，P-gp、Bcl-2的過度表達(dá)是目前較為公認(rèn)的耐藥機(jī)制。P-糖蛋白(P-gp)是Mdr-1基因產(chǎn)物，其過度表達(dá)，可使多種化療藥物泵出細(xì)胞外，減少這些藥物在細(xì)胞內(nèi)的積聚，從而表現(xiàn)為對這些藥物的耐藥[4]。Bcl-2基因是從濾泡性淋巴細(xì)胞瘤中分離出來的一種癌基因, Bcl-2蛋白是該基因的編碼產(chǎn)物, 它是一種抑制細(xì)胞凋亡的基因,具有促進(jìn)細(xì)胞生存,延長細(xì)胞壽命的作用，在多種腫瘤中得以表達(dá),特別是在白血病、淋巴瘤等惡性血液腫瘤中[5,6]。在耐藥腫瘤細(xì)胞中，Bcl-2蛋白異常高表達(dá)增強(qiáng)了其生存優(yōu)勢,是導(dǎo)致化療耐藥形成的內(nèi)在生物學(xué)基礎(chǔ)。通過下調(diào)P-gp 、Bcl-2蛋白的表達(dá)，甲孕酮可逆轉(zhuǎn)K562/AO2 細(xì)胞的耐藥性，使耐藥腫瘤細(xì)胞重新恢復(fù)藥物敏感性。因此甲孕酮與阿霉素聯(lián)合能增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，增強(qiáng)其抗腫瘤效果。本研究結(jié)果顯示10-6mol/L、10-5mol/L、 10-4mol/L濃度的甲孕酮分別作用于K562/AO2細(xì)胞株與對照組相比Bcl-2及P-gp表達(dá)減少，提示在甲孕酮作用組中Bcl-2、P-gp低表達(dá)，可使腫瘤細(xì)胞對化療藥物更敏感，更易發(fā)生凋亡，并且高濃度甲孕酮組Bcl-2 、P-gp低表達(dá)更明顯，這可能是甲孕酮逆轉(zhuǎn)其耐藥、提高化療敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用的重要機(jī)制之一。

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