(泰山醫(yī)學(xué)院化工學(xué)院,山東 泰安 271016)

咽炎片由玄參、百部、天冬、牡丹皮等12味藥組成，具有養(yǎng)陰潤肺、清熱解毒、清利咽喉、鎮(zhèn)咳止癢的功效，丹皮酚為主藥牡丹皮的有效成分，是一種小分子的酚類化合物，呈白色針狀結(jié)晶，其化學(xué)名稱為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮，具有良好的解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌和抗炎作用[1]。目前檢測丹皮酚的方法有紫外分光光度法[2]、高效液相色譜法[3-5]、氣相色譜法[6]、電化學(xué)方法[7]等。為有效地控制制劑質(zhì)量，本實驗基于AlCl3試劑對丹皮酚具有熒光增敏作用，建立了丹皮酚含量測定的熒光分析法，并成功用于咽炎片中丹皮酚含量的測定。該方法操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好、結(jié)果準確, 適合作為該品種的測定方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301熒光分光光度計(日本島津)； UV-5300紫外分光光度計；FC204型電子天平；pHS23C型酸度計。

丹皮酚溶液：稱取0.0033 g丹皮酚標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號110708-200505)，用少量甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，定容，吸取1.00 ml至100 ml容量瓶中，定容，配成0.33 μg/ml的溶液，吸取1.00 ml至100 ml容量瓶中，定容，配成3.3×10-3μg/ml的溶液；AlCl3溶液：稱取6.60 g AlCl3(分析純)，置于小燒杯中，加適量水溶解后轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，定容，配成0.50 mol/L的標準溶液；磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液：分別配成0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液和0.3 mol/L的磷酸二氫鈉溶液，按不同的比例配成pH 5.8～8.0的一系列緩沖溶液。

試驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 試驗方法

于10 ml比色管中，依次加入0.50 mol/L AlCl3溶液1.00 ml，適量的丹皮酚溶液， 1.00 ml pH 7.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，用二次水定容至10 ml。室溫放置5 min，于λem= 455 nm處測定其與試劑空白的熒光強度(λex= 295 nm)。測定體系熒光強度F與試劑空白的熒光強度F0，計算ΔF=F0- F。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外吸收光譜

考察了丹皮酚及其與Al( Ⅲ)相互作用的紫外吸收光譜，實驗發(fā)現(xiàn)，丹皮酚的最大吸收峰為275 nm，加入鋁離子其最大吸收峰紅移至295 nm，但其吸收強度變化不大，如圖1所示。這種現(xiàn)象表明丹皮酚與Al( Ⅲ )發(fā)生了反應(yīng)，生成了新的配合物。

2.2 熒光光譜

考察了丹皮酚及其與Al( Ⅲ)相互作用的激發(fā)光譜和熒光光譜，實驗發(fā)現(xiàn)，丹皮酚自身的熒光強度很弱，但加入Al( Ⅲ )后其熒光強度顯著增強，如圖2所示。實驗表明，其最大激發(fā)波長為295 nm，最大發(fā)射波長為455 nm，且在455 nm處熒光強度F值在一定范圍內(nèi)與加入的丹皮酚濃度成比例，隨著丹皮酚濃度增大，熒光強度增強。

圖1 丹皮酚及丹皮酚-鋁( Ⅲ)配合物的紫外吸收光譜

圖2 丹皮酚及丹皮酚-鋁( Ⅲ )配合物的熒光發(fā)射光譜曲線

1: 3.3 ×10-4μg/ml paeonol; 2: 1.32×10-4μg/ml paeonol + 0.05 mol/L AlCl3; 3: 1.98×10-4μg/ml paeonol + 0.05 mol/L AlCl3; 4: 2.64×10-4μg/ml paeonol + 0.05 mol/L AlCl3; 5: 3.30×10-3μg/ml paeonol + 0.05 mol/L AlCl3; 6: 3.96×10-3μg/ml paeonol + 0.05mol/L AlCl3

2.3 AlCl3用量的選擇

在實驗條件下，固定丹皮酚的濃度，考察了AlCl3用量對熒光強度的影響。實驗發(fā)現(xiàn)AlCl3溶液用量在0.60～1.50 ml范圍內(nèi)體系熒光強度增大值ΔF有較大值且穩(wěn)定。本實驗選擇0.50 mol/L AlCl3溶液用量為1.00 ml。

2.4 酸度的影響及其用量

溶液酸度影響配合物的穩(wěn)定性，進而影響其光譜性質(zhì)。向體系中加入不同pH的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，按實驗方法，分別測定含Al(Ⅲ)體系與空白體系的熒光強度值F和 F0，得到熒光強度差值ΔF。結(jié)果表明，在pH 6.6～7.4之間熒光強度增大值ΔF有較大值且穩(wěn)定。因此選擇pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液來控制體系的酸度。本實驗選用1.00 ml緩沖液為進一步實驗的最佳條件。

2.5 反應(yīng)溫度及時間的影響

本體系的反應(yīng)在室溫下能迅速完成，且升高溫度對熒光強度猝滅值無太大影響，室溫下熒光強度在10 h內(nèi)基本恒定。

2.6 工作曲線與檢出限

在最佳試驗條件下，測定了丹皮酚標準系列溶液的熒光強度。以熒光增大值ΔF對其質(zhì)量濃度繪制工作曲線。得到丹皮酚的線性回歸方程為ΔF =89.45ρ(×10-3μg/ml)- 0.2777，線性范圍為1.3 ×10-4～ 7.3 ×10-4μg/ml，相關(guān)系數(shù)r=0.999，檢出限(3s/k)為0.8 ×10-4μg/ml。

2.7 共存離子的影響

在最佳實驗條件下，丹皮酚濃度為3.3×10-4μg/ml，相對誤差不大于±5.0%時，可允許的共存物質(zhì)量(以mol/L計)為：K+(1.0)，Ca2+(0.8)，Mg2+(1.2)，Zn2+(0.5)，Ni2+(0.1)，Cu2+(0.05)，Mn2+(0.4)；Cd2+(0.2)；Hg2+(0.02)，Cr3+(0.06)，F(xiàn)e3+(0.002)。

3 樣品的測定

取10片咽炎片，除去包衣，精密稱重2.391 g，取2.00 g放入蒸餾燒瓶中，浸泡3 h加0.12 g NaCl，控制溫度在100℃蒸餾，收取50 ml餾分，再加少許水進行二次蒸餾，合并餾分，轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，定容。經(jīng)適當稀釋后用本實驗方法進行測定，同時做標準加入回收試驗，結(jié)果見表1。

表1 樣品測定結(jié)果(n=6)

[1] 呂成明,劉海燕. 丹皮酚的藥理作用研究進展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報, 2005, 24(2):142-143.

[2] 高錦紅. 六味地黃丸中丹皮酚含量的測定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(1):293-294.

[3] 孔永紅,康紅鈺.HPLC法測定金嗓清音丸中丹皮酚的含量[J].中國藥房,2011,22(8):749-750.

[4] 馮發(fā)青,王恩源,伍慶,等. HPLC 法同時測定麥味地黃膠囊中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚[J].中成藥,2012,34(12):2339-2342.

[5] 李冰,王瑜. HPLC 測定茂丹皮中的丹皮酚[J].華西藥學(xué)雜志,2010, 25 (5) :609-610.

[6] 袁杰.氣相色譜法測定丹皮酚軟膏中丹皮酚的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐, 2008, 22( 2 ) : 43-44.

[7] 吳劍, 李端, 張葉,等. 丹皮酚軟膏中的丹皮酚的超微電極快速掃描法檢測[J]. 藥物分析，2010, 30(12): 2369-2371.