趙忠潤， 陳 超， 黃嬌芳， 俞 峰， 史吉平， 孫俊松*

1.白銀賽諾生物科技有限公司，甘肅白銀730914;

2.中國科學(xué)院上海高等研究院，生物煉制實驗室，上海201210

1398食品級中性蛋白酶是一種利用枯草芽胞桿菌1398發(fā)酵產(chǎn)生的用于食品加工處理的中性蛋白酶［1］。國內(nèi)生產(chǎn)廠家在采用枯草芽胞桿菌1398發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶時，發(fā)酵液粘稠，在后提取過程中無法用傳統(tǒng)的板框壓濾使固液分離，通常將發(fā)酵液連同菌體一起進(jìn)行噴霧干燥得到產(chǎn)品［2］，這樣的產(chǎn)品不僅酶活較低，而且有很大的臭味，因此限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。目前高效的液體制劑只有外資企業(yè)能生產(chǎn)。1398中性蛋白酶的發(fā)酵原料主要由豆粕、麩皮、玉米粉等廉價原料組成，改變這些原料配方或發(fā)酵方式常用于提高產(chǎn)品單位酶活［3，4］，但是鮮有能夠改善發(fā)酵液粘性及產(chǎn)品提取工藝的功效。因此，有必要系統(tǒng)地對1398中性蛋白酶的發(fā)酵液進(jìn)行有效的菌液分離技術(shù)及蛋白質(zhì)純化工藝的研究，從而實現(xiàn)液體蛋白酶產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。

開發(fā)中性蛋白酶液體制劑的另一途徑是通過對生產(chǎn)菌種進(jìn)行物理化學(xué)方法的傳統(tǒng)誘變［5，6］，以降低發(fā)酵液粘度或提高發(fā)酵液的單位酶活;或者利用基因工程手段，將1398中性蛋白酶基因構(gòu)建到表達(dá)載體中，再重組到枯草芽胞桿菌的基因組內(nèi)進(jìn)行穩(wěn)定的外源分泌表達(dá)［7，8］。其中，以分子生物學(xué)手段研究并對工業(yè)酶進(jìn)行工程改造是工業(yè)酶的發(fā)展方向，它建立在對枯草芽胞桿菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等系統(tǒng)生物學(xué)及分泌表達(dá)系統(tǒng)、DNA重組系統(tǒng)等表達(dá)平臺的研究基礎(chǔ)上［9，10］?，F(xiàn)代工業(yè)酶的研究也要求對宿主細(xì)胞遺傳操作系統(tǒng)、目的蛋白的理化性質(zhì)等有全方位的了解。本文針對1398中性蛋白酶液體制劑的研發(fā)困境，從酶的分離純化工藝著手，改進(jìn)了蛋白酶純化工藝，進(jìn)而對純化的蛋白酶進(jìn)行了質(zhì)譜分析和基因克隆，確認(rèn)了1398中性蛋白酶的基因序列及可能的成熟肽段序列，并與模式菌株枯草芽胞桿菌168進(jìn)行了比較，為開發(fā)新一代的重組中性蛋白酶液體制劑奠定了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒

枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)1398為白銀賽諾生物科技有限公司菌種室保藏。DH5α感受態(tài)細(xì)胞為本實驗室自制;克隆載體pGEM-T vector購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試劑

質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR清潔回收試劑盒與DNA凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司;T4 DNA連接酶及DNA限制性內(nèi)切酶購自Takara公司;Taq DNA聚合酶為MBI Fermentas公司產(chǎn)品;KOD聚合酶為TOYOBO公司產(chǎn)品;其他生化試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 儀器與耗材

Maldi-Tof質(zhì)譜儀(美國英杰生命科技有限公司);Akta Purifier UPC10(美國通用公司，GE);HiprepTMSP FF16/10(20mL)陽離子交換柱(GE);大孔吸附樹脂HPD-400(河北寶恩吸附材料科技有限公司)。

1.4 培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基):NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸取物5 g/L，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

枯草芽胞桿菌1398種子培養(yǎng)基(肉湯培養(yǎng)基):牛肉膏 10 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0，121℃高壓蒸汽滅菌 20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮55 g/L，玉米粉35 g/L，豆粕 15 g/L，Na2HPO43 g/L，KH2PO40.3 g/L，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

1.5 枯草芽胞桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)

從保藏的斜面挑取一環(huán)菌體，接入20mL肉湯培養(yǎng)基中，250 r/min、32℃培養(yǎng)16 h后，取種子培養(yǎng)液4mL接入40mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 r/min、32℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h后測定酶活。

1.6 1398中性蛋白酶純化

1.6.1 離子交換型樹脂純化 采用GE預(yù)裝陽離子交換柱HiprepTMSP FF16/10在色譜儀Akta Purifier上進(jìn)行蛋白純化。取 200mL發(fā)酵液16 000 g離心10min，收集上清100mL加入100mL buffer A(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.5)稀釋后上樣，上樣比例為 1∶4，上樣量為40mL;上樣結(jié)束后，用2倍柱體積的buffer A清洗柱子，再以buffer B(20mmol/L磷酸鈉緩沖液－1 mol/L CaCl2，pH 7.5)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，測定酶活，同時收集發(fā)酵上清進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

1.6.2 工業(yè)級吸附型大孔樹脂純化 用大孔吸附樹脂制備柱床體積為20mL的純化柱。取200mL發(fā)酵液15 000 r/min離心10min，收集上清100mL加入100mL buffer A(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.5)稀釋后，以1∶4 進(jìn)行上樣，上樣量為40mL，流速為10mL/min;然后用水和buffer A各洗2個柱體積，最后分別用含10%、20%、30%、40%和50%乙醇的buffer A各洗脫2個柱體積，收集洗脫液。

1.7 1398中性蛋白酶酶活測定

按照QB/T1803-1993標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。1398中性蛋白酶1個單位酶活(U)的定義為1min內(nèi)，水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量［11］。酪氨酸測定采用紫外分光光度法，具體如下:取稀釋好的粗酶液2mL，在30℃水浴中溫浴3min，加入2mL用pH 7.5磷酸緩沖液配制的1%酪素(對照組加入4mL三氯乙酸)，混勻，30℃反應(yīng)10min，加入三氯乙酸4mL(對照組加入2mL酪素)，搖勻。取出靜置10min后過濾，取濾液于275 nm下測定吸光度，根據(jù)吸光度計算酶活力。計算蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)，純化后的比酶活與初始比酶活的比值定義為純化度。

1.8 1398中性蛋白酶蛋白鑒定與基因克隆

1.8.1 中性蛋白酶的SDS-PAGE分析 取發(fā)酵液10 μL 加入 5×上樣緩沖液3 μL，混勻，沸水煮10min，離心后進(jìn)行12%聚丙烯酞胺凝膠電泳?？捡R斯亮藍(lán)R250染色2 h，再脫色4～8 h，期間更換脫色液數(shù)次。

1.8.2 Maldi-Tof質(zhì)譜鑒定 分離后純化后的1398蛋白酶經(jīng)SDS-PAGE分離，以刀片切出單一條帶，先切碎為1 mm見方的小粒，膠內(nèi)胰蛋白酶水解，提取、標(biāo)記及質(zhì)譜鑒定方法參見Wang等［12］方法，Moldi-Tof的測定及分析由中國科學(xué)院北京基因組研究所公共技術(shù)服務(wù)中心完成。獲得樣品的肽段指紋數(shù)據(jù)后，利用MASCOT軟件與已知基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。

1.8.3 基因克隆及測序 1398枯草芽胞桿菌基因組DNA的提取參照Axygen公司試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)枯草芽胞桿菌模式菌株168 nprE基因序列(NCBI登錄號 NC_000964.3)設(shè)計引物nprEF(5'-GTGGGTTTAGGTAAGAAATTGTC-3')和nprER(5'-TTACAATCCAACAGCATTCCAGGCTG-3')，擴(kuò)增1398中性蛋白酶基因序列。所獲得的DNA片段由Axygen公司膠回收試劑盒純化，經(jīng)TA克隆，插入到pGEM-T載體中，陽性質(zhì)粒DNA由上海生工生物工程公司測序。對測得的基因序列進(jìn)行比對分析，分析工具采用里昂蛋白質(zhì)生化研究所網(wǎng)上工具(http://npsa-pbil.ibcp.fr)。

圖1 離子交換樹脂層析分離純化中性蛋白酶1398Fig.1 Purification of 1398 neutral protease by ionic exchange column chromatography.

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液酶活檢測

在工業(yè)生產(chǎn)蛋白酶的過程中，發(fā)酵液粘度較大，無法進(jìn)行后續(xù)提取純化工作，所以有必要采取離心法將固液分離，取上清進(jìn)行后續(xù)純化。在本實驗中，搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液4 500 r/min離心10min可以有效達(dá)到分離目的。取發(fā)酵液上清稀釋后測定酶活，酶活可以達(dá)到6 000 U左右;下層固體中酶活存留約1 000 U。雖然酶活有一定損失，但是離心方法用于這種粘度較高的發(fā)酵液后處理過程非常有效。

2.2 離子交換樹脂層析分離純化中性蛋白酶

采用GE預(yù)裝離子交換型樹脂HiprepTMSP FF16/10對發(fā)酵液中的中性蛋白酶1398進(jìn)行純化，結(jié)果見圖1。通過離子交換樹脂吸附發(fā)酵液中的中性蛋白酶1398，buffer B梯度洗脫過程中出現(xiàn)一個較大的吸收峰和一個較小的吸收峰，測定各收集管中洗脫液的酶活，其中較高吸收峰所對應(yīng)的收集管A10酶活最高，對各收集管中的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，A10管中的蛋白質(zhì)條帶最明顯，且目標(biāo)條帶大小(38 kDa)和原發(fā)酵液中的目的條帶大小一致(圖2)，說明分離純化得到的是目標(biāo)中性蛋白酶，而且純化后的樣品酶活損失較小，A10收集峰中的總酶活占上樣酶活的40%以上(表1)。離子交換樹脂柱層析可以有效地對發(fā)酵液進(jìn)行進(jìn)一步純化，脫色、除臭效果明顯(圖3)。雖然蛋白電泳中蛋白質(zhì)條帶并沒有明顯減少，但純化度顯示，純化后比酶活增加，而且經(jīng)過柱分離后的1398中性蛋白酶制劑澄清透明，沒有臭味，完全可以應(yīng)用于食品加工過程。

圖2 離子交換樹脂純化后中性蛋白酶1398的SDS-PAGE電泳Fig.2 SDS-PAGE of purified 1398 neutral protease by ionic exchange column chromatography.

表1 離子交換樹脂純化發(fā)酵液中中性蛋白酶1398的酶活測定Table 1 Analysis of enzyme activity of neutral proteinase 1398 purified by ionic exchange column chromatography.

圖3 發(fā)酵液純化后的脫色效果Fig.3 Decolorization of the purified fermentation broth.

2.3 工業(yè)級大孔樹脂分離純化中性蛋白酶1398

圖4 大孔樹脂分離純化中性蛋白酶1398Fig.4 Purification of 1398 neutral protease by using macroporous sorbent resin.

為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)要求，采用工業(yè)級大孔吸附樹脂對發(fā)酵液中中性蛋白酶1398進(jìn)行分離純化研究，結(jié)果見圖4。大孔樹脂吸附也是利用離子交換的原理，只是蛋白質(zhì)的解離洗脫成分不同，生產(chǎn)及回收利用的成本均比較低。比較不同濃度乙醇對吸附蛋白的洗脫效果，結(jié)果顯示，30%乙醇洗脫時吸收峰最高。對不同濃度乙醇洗脫下的收集液進(jìn)行的酶活測定也發(fā)現(xiàn)，30%乙醇洗脫液中酶活最高，但是與原發(fā)酵液中的酶活比較，損失較大，說明乙醇對酶活有抑制作用。SDS-PAGE結(jié)果顯示，蛋白酶含量與酶活結(jié)果也保持一致，30%乙醇洗脫峰中的蛋白酶濃度最高(圖5，表2)。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)，將貯有收集液的瓶敞口放置于4℃冰箱20 d左右，待乙醇揮發(fā)一部分后再次測定酶活，收集液中的酶活均有所回升(數(shù)據(jù)未顯示)，說明降低洗脫液中的乙醇濃度可以提升總酶活。使用乙醇洗脫的方法既簡單又快捷，使用的洗脫液成分可以重復(fù)使用，因此工業(yè)生產(chǎn)所帶來的化學(xué)污染較小，得到的液體中性蛋白酶產(chǎn)品無色無味，并且可以根據(jù)需要，通過進(jìn)一步的卷式膜濃縮制取得到高濃度的市售產(chǎn)品。

圖5 大孔樹脂純化后中性蛋白酶1398的SDS-PAGE電泳Fig.5 SDS-PAGE of purified 1398 neutral protease by using macroporous sorbent resin.

表2 大孔樹脂純化發(fā)酵液中中性蛋白酶1398的酶活測定Table 2 Analysis of enzyme activity of neutral proteinase 1398 purified by using macroporous sorbent resin.

2.4 1398中性蛋白酶的分子鑒定

純化得到的1398中性蛋白酶經(jīng)Maldi-Tof質(zhì)譜分析，與已發(fā)布的微生物基因組信息庫比對(結(jié)果未顯示)，確認(rèn)1398中性蛋白酶與模式菌株枯草芽胞桿菌168 NprE蛋白為同源蛋白。利用枯草芽胞桿菌168 nprE基因序列設(shè)計引物，以1398基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到約1.5 kb特異片段(圖6)，經(jīng)測序獲得1398 nprE同源基因片段，與168nprE基因序列比對分析，核苷酸序列有3個堿基不同(結(jié)果未顯示)，但僅有1個堿基變化引起蛋白質(zhì)序列改變，在靠近蛋白酶成熟肽末端，第260位氨基酸在1398中為組氨酸(His)，168中為酪氨酸(Tyr)(圖7)。

圖6 1398中性蛋白酶基因的PCR擴(kuò)增Fig.6 PCR amplication of 1398 neutral protease gene.

3 討論

AS1398是我國自主分離得到的枯草芽胞桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株，經(jīng)過多次物理化學(xué)方法誘變，可以特異性地大量分泌表達(dá)中性蛋白酶，在我國被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中［15］。但是枯草芽胞桿菌1398在發(fā)酵中粘度過大，色素等其他次級產(chǎn)物過多，對提取和最終產(chǎn)品質(zhì)量有很大影響，不再適應(yīng)當(dāng)前對中性蛋白酶產(chǎn)品規(guī)格要求的提高［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，在實驗室條件下，搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，通過離心可以很好地達(dá)到固液分離的目的，且85%以上酶活存留于發(fā)酵液上清中，可以用于進(jìn)一步純化。工業(yè)生產(chǎn)中仍需考慮更好的固液分離手段并進(jìn)一步減少固體中的酶活損失。實驗證實，離子吸附可以有效純化發(fā)酵液中的1398中性蛋白酶，且完全去除色素和異味物質(zhì)，應(yīng)用工業(yè)級大孔樹脂也可以達(dá)到實驗室級預(yù)裝柱的分離效果。

圖7 1398中性蛋白酶與模式菌株枯草芽胞桿菌168的NprE氨基酸序列比對分析Fig.7 Alignment analysis of amino acid sequence between 1398 neutral protease and NprE of Bacillus subtilis 168.

本研究利用質(zhì)譜分析對該蛋白酶的序列進(jìn)行了分析，確定了中性蛋白酶的序列，建立了后期進(jìn)行異源分泌表達(dá)生產(chǎn)、蛋白酶定向工程改造的研究基礎(chǔ)［17，18］。本研究利用質(zhì)譜分析首次確定了1398蛋白酶與枯草芽胞桿菌模式菌株168 NprE為同源蛋白，已獲得的1398蛋白酶片段與168 NprE蛋白之間僅有1個氨基酸的差異。但根據(jù)168 nprE序列全長，無法在1398基因組中獲得類似的上游序列(結(jié)果未顯示)，說明1398菌株作為工業(yè)生產(chǎn)菌株，與模式菌株168存在較大差異，1398菌株中性蛋白酶編碼基因上游調(diào)控序列可能與1398菌株中性蛋白酶高產(chǎn)性狀相關(guān)，下一步工作將克隆上游調(diào)控序列，從而解析與發(fā)酵產(chǎn)量、發(fā)酵液粘度等相關(guān)的分子機(jī)理，并為進(jìn)行高效的外源重組表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

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