楊海峰， 劉景輝， 王俊英

1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特010019;

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

Na+在植物體內(nèi)各個(gè)組織、器官中的分布與作物的耐鹽性密切相關(guān)，Na+/K+比是衡量作物耐鹽性的一個(gè)重要指標(biāo)。植物中Na+和K+為競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系，因此鹽脅迫下通常造成植物中Na+的過量滲入和K+的降低。研究發(fā)現(xiàn)，限制Na+吸收、增加Na+外排，同時(shí)保證K+的吸收，維持細(xì)胞質(zhì)低Na+/K+比是植物維持正常代謝和提高抗鹽性的關(guān)鍵［1～4］。Ca2+作為第二信使，能夠在植物體內(nèi)傳遞鹽信號(hào)，開啟體內(nèi)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將根部多余的Na+泵出體外，將地上部分莖、葉中的Na+轉(zhuǎn)到液泡中以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的Na+平衡，以減少Na+對(duì)植物的毒害［5，6］。

燕麥主要種植在我國(guó)西北土壤貧瘠地區(qū)，具有較強(qiáng)的抗旱、耐鹽堿能力，在荒漠化治理，改善當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境方面有重要作用。為研究不同燕麥品種的耐鹽性，本實(shí)驗(yàn)選取了4個(gè)燕麥種植區(qū)的主栽品種，應(yīng)用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法測(cè)定了不同燕麥品種在不同pH生長(zhǎng)條件下，不同器官中的離子含量。

ICP-MS分析技術(shù)是一種無機(jī)微量及痕量元素分析技術(shù)，近年來發(fā)展迅速，該技術(shù)精密度高、線性范圍寬、簡(jiǎn)便快速、干擾少、可多元素同時(shí)分析，檢出限一般比電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)低2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。應(yīng)用ICP-AES測(cè)定植物無機(jī)元素的研究較多［7～11］，在測(cè)定植物體內(nèi)不同器官離子含量中引入電感耦合等離子體質(zhì)譜測(cè)定方法的研究還很少，主要應(yīng)用在醫(yī)藥類、生物樣品、地質(zhì)樣品中測(cè)定多種微量元素［12～14］。

本研究首次應(yīng)用這種高靈敏度的快速檢測(cè)方法檢測(cè)不同離子間的微弱變化，可以為精準(zhǔn)評(píng)價(jià)燕麥的耐鹽性提供理論基礎(chǔ)和分析方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)選用4個(gè)裸燕麥品種。其中，燕科一號(hào)為內(nèi)蒙古農(nóng)科院選育的本地主栽品種，壩莜8號(hào)、花早2號(hào)和白燕2號(hào)為其他省市選育的栽培品種。種子均采自內(nèi)蒙古武川縣燕麥品種異地鑒定示范基地。

1.2 主要儀器

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent7500cx型);Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試劑

HNO3為優(yōu)級(jí)純?cè)噭?水為超純水(18.2 MΩ)。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:10 mg/L Na、K、Ca混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(5%HNO3介質(zhì))，購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，以0.32 mol/L HNO3逐級(jí)稀釋備用。

內(nèi)標(biāo)溶液:由 100 mg/L Sc、Ge、In、Bi的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋為10 mg/L(5%HNO3介質(zhì))(Agilent，Part#5188-6525)。

（一）醫(yī)療服務(wù)定價(jià)原則與辦法缺乏頂層設(shè)計(jì)。中國(guó)地域遼闊，經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平差距大，財(cái)政補(bǔ)助政策差異更大，各地區(qū)醫(yī)療服務(wù)價(jià)格定價(jià)辦法有多種，國(guó)家衛(wèi)生、發(fā)改、財(cái)政等部門雖然出臺(tái)了《醫(yī)療服務(wù)價(jià)格規(guī)范》，但沒有統(tǒng)一的定價(jià)原則，定價(jià)辦法。沒有調(diào)價(jià)的程序、調(diào)價(jià)的依據(jù)、調(diào)價(jià)的范圍、調(diào)價(jià)的幅度、調(diào)價(jià)的方法規(guī)制。從專家發(fā)表的研究資料中披露了多種定價(jià)方法，已經(jīng)為政府主管部門制定價(jià)格定價(jià)原則和辦法提供了思路。

調(diào)諧溶液:1 μg/L Li、Mg、Y、Ce、Tl、Co 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(5%HNO3介質(zhì))(Agilent，Part#5185-5959)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品處理 將供試的4個(gè)裸燕麥品種分別播種于兩種土壤中，pH分別為8.0和8.8，其他養(yǎng)分條件一致，盆栽。每份材料播種3盆(3次重復(fù))，每盆播種30粒。待盆內(nèi)幼苗長(zhǎng)到約15cm后，保留生長(zhǎng)健壯且基本一致的20株幼苗繼續(xù)培養(yǎng)，生長(zhǎng)50 d后，分別取0.5 g根、莖、葉組織，加800目石英砂研磨，用滅菌的去離子超純水定容到5mL，室溫放置4 h，8 000 r/min離心，取上清液，過0.22 μm濾膜后作為上樣樣品待測(cè)。

1.4.2 儀器條件的優(yōu)化 采用Agilent公司調(diào)諧溶液在儀器設(shè)置的Tune程序下對(duì)儀器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在優(yōu)化的工作條件下，Li、Y和Tl的靈敏度分別不低于 3 000、8 000和 4 000，氧化物含量(156CeO+/140Ce+)＜1.5%，雙 電 荷 干 擾(70Ce2+/140Ce+)＜3%。為了盡可能減少質(zhì)譜干擾，提高檢測(cè)靈敏度，選用23Na、39K和43Ca為同位素。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以0.32 mol/L HNO3將 Na、K、Ca混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋為 0、0.01 μg/L、0.05 μg/L、0.10 μg/L、0.50 μg/L和1.00 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用儀器優(yōu)化參數(shù)，測(cè)定空白樣品及系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定線性相關(guān)系數(shù)。

1.4.4 方法檢出限的測(cè)定 使用儀器優(yōu)化參數(shù)，測(cè)定空白樣品，取10次平行結(jié)果;測(cè)定各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，取3次平行結(jié)果，按以下公式計(jì)算方法的檢出限。

檢出限(ng/L)=［3(σ/(S－B)］×C

1.4.5 方法的重復(fù)性驗(yàn)證 對(duì)Na、K、Ca混合標(biāo)準(zhǔn)液分兩個(gè)濃度分別進(jìn)行9次平行測(cè)定，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4.6 燕麥樣品的測(cè)定 每一個(gè)燕麥樣品分別進(jìn)行9次平行測(cè)定，一次上樣量2mL，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

儀器自動(dòng)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線和確定的線性相關(guān)系數(shù)見表1。如表1所示，測(cè)定不同稀釋濃度Na+、K+、Ca2+含量的相關(guān)系數(shù)均在 0.99 以上，表明優(yōu)化后的儀器測(cè)定條件及標(biāo)品可用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

表1 Na+、K+、Ca2+標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)Table 1 The linear correlation of standard curve of Na+，K+and Ca2+.

2.2 方法檢出限的確定

按1.4.4中的測(cè)定方法測(cè)定，所得結(jié)果代入公式計(jì)算得出方法的檢出限。各元素檢出限分別為 K+:10.0 ng/L、Na+:8.0 ng/L、Ca2+:5.0 ng/L。

2.3 方法重復(fù)性的驗(yàn)證

對(duì)Na、K、Ca混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行9次平行測(cè)定，結(jié)果見表2。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，誤差在痕量分析允許范圍內(nèi)，表明方法精密度良好。

表2 測(cè)定方法的重復(fù)性驗(yàn)證Table 2 Verification of repeatability of the determination method.

2.4 燕麥樣品中Na+、K+和Ca2+含量的分析

四個(gè)裸燕麥品種在不同pH下生長(zhǎng)，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定根、莖和葉中Na+、K+和Ca2+含量，結(jié)果見表3。

表3 四個(gè)裸燕麥品種根、莖、葉中Na+、K+、Ca2+含量Table 3 Content of Na+，K+and Ca2+in roots，stems and leaves of four oat varieties.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)土壤pH增大時(shí)，四個(gè)裸燕麥栽培品種莖和葉中的Na+含量都在升高，而在根中顯示了不同的趨勢(shì)，花早2號(hào)和白燕2號(hào)Na+含量是隨著pH的升高而降低的。但是在測(cè)試的4個(gè)裸燕麥栽培品種中相同的趨勢(shì)是，在低鹽堿(pH 8.0)生長(zhǎng)條件下，燕麥植株中Na+的累積主要在根部，Na+在整個(gè)植株中的分布是根中含量大于莖，莖大于葉;在高鹽堿(pH 8.8)處理?xiàng)l件下，不同燕麥品種中Na+的累積主要在莖而不是根，莖中Na+含量高于根和葉片，表明這四個(gè)裸燕麥品種應(yīng)答鹽堿脅迫的機(jī)制主要是將Na+隔離在莖中以減少根和葉中的Na+含量，維持燕麥正常生長(zhǎng)。

分析K+含量顯示:在低鹽堿生長(zhǎng)條件下，只有根中的K+含量低于Na+，莖和葉中K+均高于Na+;在高鹽堿脅迫下，只有葉片中的K+含量高于Na+含量，表明供試的四個(gè)燕麥品種在受到土壤pH升高脅迫時(shí)，首先維持葉片中低Na+/K+比值。結(jié)果同樣顯示4個(gè)裸燕麥品種無論是在高鹽堿還是低鹽堿條件下，都能夠維持葉片中Na+/K+比值最低(見圖1)，維持葉片的低Na+/K+比值是植物在鹽堿條件下能夠正常生長(zhǎng)的條件。

在正常生長(zhǎng)條件下，植物地上部莖、葉含有較多的鈣，而根部中則較少［5，6］，檢測(cè)結(jié)果顯示，無論在土壤低鹽堿條件(pH 8.0)還是高鹽堿條件(pH 8.8)下，四個(gè)裸燕麥品種中Ca2+的積累主要在根部，Ca2+的濃度在根部的含量最高(見圖2)，表明Ca2+含量對(duì)土壤pH的敏感度更高，推測(cè)對(duì)燕麥而言，在受到鹽堿脅迫時(shí)，Ca2+可能是先于Na+和K+發(fā)生含量變化的離子。

圖1 4個(gè)裸燕麥品種在不同pH條件下根、莖、葉中Na+/K+比值Fig.1 Na+/K+ratio in root，stem and leaf from four oat varieties under growth condition with different pH value.

圖2 4個(gè)裸燕麥品種在不同pH條件下根、莖、葉中Ca2+含量Fig.2 Comparison of Ca2+in root，stem and leaf of four oat varieties under growth condition with different pH value.

3 討論

植物在受到鹽堿脅迫時(shí)，對(duì)Na+、K+和Ca2+的吸收與累積是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，很多時(shí)候各離子的變化非常微弱，但是這種微弱的變化所導(dǎo)致的Na+、K+和Ca2+比例的變化有可能成為一系列生理變化的原因之一，因此采用更靈敏的檢測(cè)方法來測(cè)定鹽堿脅迫下植株體內(nèi)離子的濃度，是深入研究離子濃度變化與生理變化關(guān)系的一個(gè)有力手段。通常測(cè)定植物Na+、K+、Ca2+含量一般是使用原子吸收方法［15］，在大量測(cè)定樣品時(shí)耗時(shí)較長(zhǎng)，而且原子吸收相對(duì)ICP-MS而言，靈敏度較低［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ICP-MS適用于作物體內(nèi)各個(gè)器官不同離子含量的分析，可用作為研究植物抵抗環(huán)境離子脅迫生理機(jī)制研究方面的一個(gè)工具。

研究發(fā)現(xiàn)，植株對(duì)抗鹽脅迫必須限制Na+的滲入，增加Na+外排，同時(shí)保證K+的吸收，特別是在植物生長(zhǎng)點(diǎn)及幼嫩葉片處保持低Na+。維持細(xì)胞質(zhì)低 Na+/K+比值是植物抗鹽性的關(guān)鍵［1］。Volkov等［17］研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫條件下，鹽芥根部Na+內(nèi)流明顯小于擬南芥根部Na+內(nèi)流，因此比擬南芥更具耐鹽性。郭房慶等［18］比較了鹽脅迫下抗鹽突變體和野生型小麥Na+、K+累積的差異，發(fā)現(xiàn)抗鹽突變體的根、尤其是葉中Na+的相對(duì)累積顯著低于野生型，而K+的累積則顯著高于野生型。本研究對(duì)耐鹽堿作物燕麥的檢測(cè)結(jié)果顯示，在高鹽堿(pH 8.8)處理?xiàng)l件下，不同燕麥品種中Na+的含量主要累積在莖而不是根、葉中，推測(cè)燕麥在鹽脅迫下抵抗離子脅迫的應(yīng)答反應(yīng)是將根中的Na+向上運(yùn)送到莖，并且減少莖向葉片中的運(yùn)輸，以維持根和葉中有較低的Na+含量及Na+/K+比。根是植物吸收水分、養(yǎng)分的主要器官，降低根部Na+濃度有利于K+及其他養(yǎng)分，水分的吸收;葉片是植物進(jìn)行光合作用、蒸騰作用等生命過程主要場(chǎng)所，推測(cè)維持葉片低Na+/K+比是燕麥在鹽脅迫下能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育的條件。

由于植物體內(nèi)鈣的主要運(yùn)輸動(dòng)力是蒸騰作用，當(dāng)作物在高鹽堿條件下的水分吸收以及蒸騰作用受到限制時(shí)，根部向上運(yùn)輸鈣的過程受限，鈣主要累集在根部。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然這四個(gè)裸燕麥栽培品種Ca2+的吸收在高鹽堿條件下顯著降低，但鈣的積累仍然主要在根部，這表明當(dāng)土壤pH 8.8時(shí)，4個(gè)燕麥品種中鈣的向上運(yùn)輸均已受抑，其中花早2號(hào)無論在低鹽堿還是高鹽堿條件下均在根中累集了大量的Ca2+，并且在高鹽堿條件下葉片中Na+/K+比最高，推測(cè)花早2號(hào)是供試的4個(gè)裸燕麥品種中耐鹽堿性較弱的一個(gè)品種。

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