范 晴，謝芝勛，謝志勤，劉加波，龐耀珊，鄧顯文，謝麗基，羅思思

（廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧530001）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）可引起的牛的致死性腹瀉，呼吸及繁殖障礙，是養(yǎng)牛業(yè)中較為常見的傳染病。臨床特征為發(fā)熱，腹瀉，急、慢性黏膜病，白細(xì)胞減少，持續(xù)性感染與免疫耐受，免疫抑制等，懷孕母牛感染BVDV后，可引起死胎、流產(chǎn)，胚胎畸形或分娩出表面看似正常的持續(xù)感染的犢牛［1-2］。目前BVDV的檢測方法主要有RT-LAMP，RT-PCR，實(shí)時(shí)熒光定量PCR等［3-4］。這些方法雖然快速，但只有BVDV牛呈急性腹瀉時(shí)才可以從排泄物中直接檢測到病毒粒子。然而大多數(shù)牛感染BVDV是呈持續(xù)性感染，不表現(xiàn)臨床癥狀，這些持續(xù)感染的犢牛一旦再次接觸BVDV相似性抗原就會繼發(fā)為黏膜病，表現(xiàn)為急性脫水性腹瀉，病死率可高達(dá)100%，即使不成為黏膜病也終身帶毒，持續(xù)排毒，是養(yǎng)牛業(yè)潛在的危害，可造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。只有檢測BVDV抗體才能真正確診BVDV持續(xù)感染的牛。該病的防控主要依靠檢測出這些持續(xù)性感染的牛并淘汰，逐步凈化牛群［5-6］。由于BVDV僅有一種血清型，因此本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)NS3基因，目的是獲得有免疫活性的BVDV NS3囊膜蛋白，制備出具有良好反應(yīng)原性的抗原，為BVDV野毒感染檢測試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BVDV分離株Oregon CV24凍干毒及標(biāo)準(zhǔn)BVDV陽性血清均購于中國獸藥監(jiān)察所；MDBK 細(xì)胞購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心；Pet-32a原核表達(dá)載體購自Novagen公司，限制性內(nèi)切酶SalⅠ和NotⅠ、PMD-18T 克隆載體、DNA Marker、T4連接酶購自TaKaRa公司；NC膜購自Invitrogen公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、凝膠回收試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TransGen公司；兔抗牛IgG／辣根酶（HRP）標(biāo)記購自KPL 公司；蛋白純化試劑盒購自北京康為公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取Oregon CV24毒株參照文獻(xiàn)在MDBK細(xì)胞上增殖，48h收獲病毒，反復(fù)凍融3次后，離心取上清，參照Invitrogen公司Trizol說明書抽提病毒RNA，用TransGen公司的cDNA Synthesis SuperMix 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和PCR 擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 中的Oregon CV24基因序列（Genbank登錄號：0911605.1），利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對特異性引物，擴(kuò)增NS3基因，擴(kuò)增的目的片段為1 206bp，引物均由Invitrogen公司合成，下劃線部分分別為SalⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。NS3 上：5′-GTCGACTTACCAGTATGAACAGGGGAG -3′，NS3 下：5′-GCGGCCGCTGTTGTATGCAAGTTGGATTG-3′。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建 用膠回收試劑盒純化PCR 產(chǎn)物，連接入PMD-18T 克隆載體，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α，用PCR 篩選陽性克隆，構(gòu)建PMD-18T-NS3。抽提PMD-18T-NS3質(zhì)粒和Pet-32a質(zhì)粒，兩種質(zhì)粒同時(shí)用SalⅠ和NotⅠ雙酶切后，把NS3片段與酶切后的pET-32a載體用TaKaRa T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Transetta（DE3），置37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落，經(jīng)PCR鑒定，陽性菌送上海Invitrogen公司測序。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a-NS3，用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切。

1.2.4 重組蛋白的可溶性鑒定 將測序正確的陽性菌液以1∶100的比例接種于50 mL LB＋AMP的培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600nm 值為0.55～0.65 時(shí)，向重組菌中加入IPTG 至終濃度為1 mmol／L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，30℃繼續(xù)培養(yǎng)8h后收集菌液，10 000r／min離心15min，棄上清，用5mL PBS重懸菌體沉淀，加入溶菌酶（終濃度為100μg／mL），混勻后，置37℃和-70℃之間反復(fù)凍融3次，冰浴進(jìn)行超聲波裂解，破碎菌體直至菌液呈清亮，10 000 r／min離心10 min，分別取上清與沉淀進(jìn)行SDSPAGE電泳，以確定重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)方式，如果主要的表達(dá)產(chǎn)物在上清，則該蛋白為可溶性表達(dá)，如果主要的表達(dá)產(chǎn)物在沉淀，則該蛋白為包涵體表達(dá)。

1.2.5 重組蛋白的純化 參照康為公司Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（包涵體蛋白）說明書進(jìn)行純化。將洗脫蛋白裝入已處理過的透析袋里，并把透析袋置于復(fù)性緩沖液（1×PBS，1 mmol／L EDTA，尿素，pH 8.0）中，于4℃逐步透析復(fù)性，復(fù)性緩沖液中尿素濃度不斷下降，依次順序?yàn)?.5、3.5、2.5、1.5、0.5、0mol／L，換液間隔時(shí)間為10h～12h。透析結(jié)束后，收集蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，確定復(fù)性和純化的效果。

1.2.6 Western blot檢測 純化好的NS3蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，用上海Invitrogen 公 司W(wǎng)estern blot干轉(zhuǎn)儀，將蛋白條帶轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜（NC膜）上，同時(shí)設(shè)空菌體對照。NC膜用50g／L脫脂奶37℃封閉1h～2h，用PBST洗滌3次；加入1∶100稀釋的BVDV 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，37℃孵育1h后，再用PBST洗滌3次；加入1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗牛IgG，37℃孵育1h，PBST 洗膜3次；最后用DAB顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET-32a-NS3的鑒定

將構(gòu)建好的pET-32a-NS3表達(dá)載體用PCR鑒定，NS3片段已成功插入載體中（圖1）。雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，可成功地從pET-32a-NS3中切出NS3片段，大小為1 206bp，空載體pET-32a未切出條帶（圖2）。重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示，NS3 主要抗原區(qū)已成功插入pET-32a 載體中，與GenBanK 中的BVDV 核苷酸同源性為91%～100%，氨基酸同源性在94%以上。

圖1 PCR鑒定結(jié)果Fig.1 The results of PCR identification

圖2 Pet-32a-NS3重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid Pet-32a-NS3by double enzyme digestion

2.2 重組蛋白的可溶性鑒定

經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，重組NS3蛋白得到較好表達(dá)，超聲波破裂細(xì)菌后取上清和沉淀分別進(jìn)行SDSPAGE，NS3的表達(dá)產(chǎn)物主要在沉淀部分，即為包涵體表達(dá)形式（圖3）。

2.3 重組蛋白純化結(jié)果

經(jīng)試劑盒純化后，得到較高濃度與純度的NS3蛋白。經(jīng)OD260nm 和OD280nm 檢測分析，NS3的濃度分別為2.08mg／mL。通過SDS-PAGE檢測重NS3組蛋白的純度，結(jié)果顯示，純化的效果較好，均可得到單一的目的條帶，無雜帶（圖3）。

2.4 Western blot結(jié)果

用BVDV 陽性血清進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，NC膜上重組NS3蛋白出現(xiàn)清晰的特異性印跡條帶，而空菌體對照無特異性條帶，表明重組NS3蛋白反應(yīng)活性較好（圖4）。

圖3 NS3在大腸埃希菌中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測Fig.3 SDS-PAGE of NS3expression products in E.coli

圖4 NS3重組蛋白的Western blot檢測結(jié)果Fig.4 Western blot detection results of NS3recombinant proteins

3 討論

據(jù)報(bào)道BVDV 在我國廣泛存在，安徽、江蘇、廣西?。▍^(qū)）BVDV 感染率為分別為34.2%、8.4%和10%［7］。大部分情況下BVDV 以持續(xù)性感染而不發(fā)病的形式存在于牛體內(nèi)，持續(xù)排毒成為潛在的感染源。由于BVDV 發(fā)病機(jī)理及臨床特征的復(fù)雜性，只有當(dāng)BVDV 牛呈急性腹瀉時(shí)才可以從排泄物中直接檢測到病毒粒子，因此用RT-PCR、RT-LAMP等一系抗原檢測技術(shù)容易漏檢。BDVD 抗體的檢測才能對持續(xù)性感染的牛進(jìn)行確診，真正監(jiān)測畜群BVDV 的感染狀況。選擇NS3 蛋白表達(dá)的理由如下：①NS3具有較高的免疫原性，是一種免疫優(yōu)勢蛋白，在病毒感染過程中，免疫系統(tǒng)的CD4＋T 細(xì)胞主要識別NS3 和E2 兩種蛋白，并可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生針對該蛋白的抗體［8］。②核苷酸序列分析表明，NS3編碼區(qū)不僅在BVDV 各毒株間都較保守，且在不同基因型（BVDV-1和BVDV-2）和生物型（細(xì)胞病變型和非細(xì)胞病變型）中也是非常保守的［11］。③目前國際上對該病的控制主要依賴BVDV 滅活疫苗，NS3是BVDV 的非結(jié)構(gòu)蛋白，當(dāng)滅活疫苗刺激機(jī)體時(shí)，主要產(chǎn)生的針對結(jié)構(gòu)蛋白的抗體，因此對NS3抗體的測定，將有助于區(qū)分疫苗免疫和野毒感染［9-11］。利用原核表達(dá)系統(tǒng)在體外表達(dá)蛋白，可獲得高純度的蛋白，用于ELISA 診斷抗原不僅制備方便，安全，而且特異性好，在動物疫病的診斷上得到廣泛應(yīng)用［12-14］。

本研究制備的BVDV NS3蛋白能與BVDV 陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)且濃度高，適合于下一步大量的制備，為建立BVDV ELISA 檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)，用于區(qū)分疫苗免疫和野毒感染。

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