戴光文，謝麗華＊，江精華，李 媚，梁 真，蘇志毅，嚴(yán) 紅

（1.梧州市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西梧州543002；2.梧州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣西梧州543002）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS，又稱豬藍耳?。┦怯韶i繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種急性傳染病，以母豬繁殖障礙、仔豬高病死率、發(fā)熱、藍耳、呼吸困難為特征。該病于1987年首次在美國報道［1］，此后世界各地均有發(fā)生。歐美先后分離到病原，分別被鑒定為歐洲型和美洲型兩種基因型。我國在1996年首次分離到美洲型PRRSV［2］，迄今國內(nèi)以該型毒株流行為主。2006年在我國南方高熱豬群中發(fā)現(xiàn)美洲型PRRSV NSP2基因發(fā)生缺失變異［3］，形成具有高致病性的毒株，對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大。當(dāng)前我國豬群同時遭受美洲型PRRSV 高致病性毒株和經(jīng)典毒株的侵害［4］，兩種毒株引起的豬群癥狀和病變幾乎相同，難以從臨床上進行區(qū)分，逐一進行實驗室鑒定存在耗時過長、浪費試劑等缺點。本研究旨在建立可以同時檢測美洲型PRRSV 高致病性和經(jīng)典毒株的RT-PCR鑒別方法，并以此開展豬藍耳病的快速診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 總RNA 提取試劑盒和DNA Marker（TIANGEN）；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、重組核酸酶抑制劑、TaqDNA 聚合酶和dNTP Mix（Invitrogen）；核酸染料GelRed（Biotium）；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Nsp2 1594～1680變異株）RT-PCR檢測試劑盒（北京世紀(jì)元亨），用于比較試驗。

1.1.2 儀器設(shè)備 PCR 儀、高速冷凍離心機、凝膠成像系統(tǒng)（珠海黑馬公司）；電泳儀槽（君意JY600C）、微量移液器（芬蘭Beta）、二級生物安全柜（BHC-1300ⅡA2）等。

1.1.3 參照物 變異株TJM-F92、經(jīng)典株CH-1R活疫苗（每頭份不少于105.0TCID50）分別用于PRRSV 兩種毒株的陽性對照。豬瘟（細胞源）、豬偽狂犬?。℉B-98株）、豬乙型腦炎（SA14-14-2株）、豬傳染性腹瀉-豬流行性腹瀉-輪狀病毒三聯(lián)活疫苗用于特異性試驗。

1.1.4 樣品來源 10份豬血清（編號X1～X10）采自散養(yǎng)戶臨床無癥狀豬，6份豬組織（編號Z1～Z6）為屠宰場豬有病變的肺、脾、淋巴結(jié)混樣。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank 登陸的美洲型PRRSV TJ株（登錄號EU860248）、CH-1a株（登錄號AY032626）及其他毒株核苷酸全序列，綜合利用Primer 5.0和Oligo 6生物軟件分析，設(shè)計一對可以同時擴增變異毒株和經(jīng)典毒株NSP2基因的特異性共有引物（位于NSP2不連續(xù)缺失90個核苷酸位點兩端，上游引物P1：5′-TCCACCAAGAGTTCAACCT-3′，下 游 引 物P2：5′-GACGCAGACAAATCCAGAG-3′），預(yù)期擴增基因片段分別為342bp（變異毒株）和432bp（經(jīng)典毒株）。引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2 抽提和RT-PCR 取稀釋后的活疫苗或臨床樣品上清液200μL，按照總RNA 提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄酶說明書提取RNA 和進行RT。對PCR 反應(yīng)體系進行優(yōu)化，最終確定為10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2（50mmol／L）0.75μL，上、下游引物（10 μmol／L）和dNTP Mix（10 mmol／L）各0.5μL，DNA 聚合酶（5U／μL）0.2μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL，加滅菌水至25μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，35 個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 配制新鮮的1×TAE 電泳液和12g／L瓊脂糖凝膠（經(jīng)GelRed染色），每孔加入PCR 產(chǎn)物8μL，電壓8V／cm，室溫25℃，電泳后拍照。

1.2.4 特異性、敏感性、重復(fù)性和比較試驗 利用滅菌生理鹽水將豬瘟、豬偽狂犬病、豬乙型腦炎、豬傳染性腹瀉-豬流行性腹瀉-輪狀病毒等活疫苗稀釋后作為待檢樣品進行RT-PCR 特異性試驗。將TJM-F92株、CH-1R 株 活 疫 苗 按 照101、102、103、104、105、106倍連續(xù)稀釋后進行RT-PCR 敏感性擴增。用本研究方法對10份臨床樣品進行3次重復(fù)檢測，并與商品化試劑盒檢測比較。

1.2.5 臨床應(yīng)用 對臨床16份樣品進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR建立及特異性試驗結(jié)果

CH-1R、TJM-F92均擴增出預(yù)期大小的目的片段（即432bp和342bp），陰性對照、豬瘟、豬偽狂犬病、豬乙型腦炎、豬傳染性腹瀉、豬流行性腹瀉、輪狀病毒沒有擴增出條帶（圖1）。

圖1 RT-PCR 特異性檢測Fig.1 RT-PCR specificity assay

圖2 變異株敏感性試驗Fig.2 The sensitivity test of the variant strain

2.2 敏感性試驗結(jié)果

反應(yīng)體系能擴增出105倍稀釋的變異株模板（圖2）和104倍稀釋的經(jīng)典株模板（圖3），可以檢測出低至101TCID50的病毒感染量。

2.3 重復(fù)性試驗及與商品化試劑盒比較結(jié)果

圖3 經(jīng)典株敏感性試驗Fig.3 The sensitivity test of the classic strain

對豬血清（X6～X10）和豬組織（Z1～Z5）利用本法重復(fù)3次檢測，樣品X9、Z1、Z4、Z5為PRRS變異株陽性，其他樣品為陰性，3次結(jié)果無差異。利用商品化豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Nsp2 1594～1680變異株）RT-PCR檢測試劑盒檢測，陽性出現(xiàn)278 bp，結(jié)果與研究建立的方法符合率100%（圖4）。

2.4 臨床樣品檢測結(jié)果

從散養(yǎng)戶和屠宰場16份樣品中檢測出經(jīng)典株陽性1份（圖5血清X2），變異株陽性5份（圖5血清X9；圖6 組 織Z1、Z4～Z6），總體陽性率為37.5%，變異株占總毒株數(shù)的83.3%。

圖4 商品化試劑盒檢測結(jié)果Fig.4 Detection results by commercial kit

圖5 豬血清檢測結(jié)果Fig.5 Detection results of pig sera

圖6 豬組織檢測結(jié)果Fig.6 Detection results of pig tissues

3 討論

PRRSV 診斷方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）［5］、免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）［6］、血清病毒中和試驗（SVN）［7］、直接免疫熒光試驗（IFA）［8］、病毒分離鑒定［9］、核酸序列測定［10］、針對單一PRRSV 毒株的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）［11］等。前3 種方法常用于抗體檢測，不能區(qū)分免疫抗體和野毒感染抗體。IFA、病毒分離鑒定、核酸序列測定可以準(zhǔn)確地對病原做出鑒定，但耗費較長時間，不適合快速診斷。常規(guī)非鑒別性RTPCR 方法雖然快速，但是無法同時檢測變異株和經(jīng)典株感染。本研究利用美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株相對于經(jīng)典株在NSP2基因上不連續(xù)缺失90個核苷酸的標(biāo)志特征，設(shè)計特異性共有引物，可以同時快速對2種毒株進行鑒別檢測。瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對相差90bp 的2 個較大分子量片段（500bp以上）很難用肉眼分辨，因此本研究設(shè)計的引物擴增片段（432bp和342bp）在標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量400bp條帶附近，電泳后用肉眼清晰辨別，不用測序即可快速鑒別。

試驗表明本研究建立的方法具有良好特異性、敏感性、重復(fù)性和可靠性，只能擴增出美洲型PRRSV 基因，豬群當(dāng)中常見的CSFV、PRV、JEV、TGEV、PEDV、RV 等病毒不會干擾結(jié)果，可擴增出低至101TCID50的病毒感染量，可以與國內(nèi)優(yōu)秀商品化試劑盒媲美。該法需要注意，1孔DNA Marker最多給予6個樣品提供參照，否則電泳斜度可能造成分辨誤差。在電泳過程中要控制電壓溫度，并且使用新配置的電泳液和凝膠才能跑出良好效果。

臨床上從豬血清、豬組織中都可以檢測出PRRSV，表明建立的方法可以用于活體豬常規(guī)監(jiān)測，也可以用于病死豬鑒定檢測。豬血清陽性率（2／10）低于豬組織陽性率（4／6），這與PRRSV 侵入機制、細胞受體和體內(nèi)分布有關(guān)［12-13］。PRRSV 主要侵害含有巨噬細胞的器官如肺臟、淋巴結(jié)等，在肺臟中含量高且維持時間長，在血液中含量稍低且維持時間短。變異株所占總毒株的83.3%，表明當(dāng)前豬群主要以高致病性變異毒株流行為主，這與相關(guān)報道結(jié)果一致［14-16］。通過檢測發(fā)現(xiàn)，屠宰場和散養(yǎng)戶都是豬藍耳病發(fā)生風(fēng)險點，要加強監(jiān)控。

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