曲紅梅，姜艷輝，孫偉，朱新冰

(遼河油田總醫(yī)院急診科1、普外科2，遼寧盤錦124010)

·論著·

紫杉醇聯(lián)合5-Aza-dC對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446生長抑制作用的研究

曲紅梅1，姜艷輝2，孫偉1，朱新冰2

(遼河油田總醫(yī)院急診科1、普外科2，遼寧盤錦124010)

目的 探討紫杉醇(PAC)聯(lián)合DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-dC)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446增殖遷徙及侵襲能力的影響。方法將人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446給予紫杉醇及5-Aza-dC干預(yù)處理，根據(jù)藥物干預(yù)方式的不同分為對(duì)照組、紫杉醇組及聯(lián)合用藥組；應(yīng)用CCK-8法檢測各組NCI-H446細(xì)胞增殖能力的差異；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組NCI-H446細(xì)胞遷移和侵襲能力的差異。結(jié)果CCK-8結(jié)果顯示PAC及5-Aza-dC均可抑制NCI-H446細(xì)胞的增殖活性，且呈時(shí)間依賴性。48 h后紫杉醇組及聯(lián)合用藥組NCI-H446細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組明顯減弱(P＜0.01)；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示劃痕形成24 h后，對(duì)照組劃痕愈合率為(69.15±0.837)%。而在紫杉醇組劃痕處愈合率為(47.30±0.783)%；聯(lián)合用藥組劃痕愈合率為(43.45±0.862)%。紫杉醇組及聯(lián)合用藥組NCI-H446細(xì)胞在遷移能力方面較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組NCI-H446細(xì)胞轉(zhuǎn)染穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量為(151.4±6.88)個(gè)，紫杉醇組為(66.8±5.17)個(gè)，聯(lián)合用藥組為(40.2±4.55)個(gè)。紫杉醇組及聯(lián)合用藥組NCI-H446細(xì)胞的侵襲能力較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論5-Aza-dC作為化療增敏劑可增加非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446對(duì)紫杉醇的敏感性，從而提高紫杉醇對(duì)非小細(xì)胞肺癌的化療效果。

非小細(xì)胞肺癌；5-Aza-dC；紫杉醇；化療增敏劑

全球范圍內(nèi)無論是男性或女性，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)均是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的首要原因，其惡性程度高，常對(duì)化療產(chǎn)生耐藥或復(fù)發(fā)。盡管早期患者可以經(jīng)手術(shù)完全切除病灶，但是ⅠA期患者5年死亡率仍有33%，ⅢA期患者達(dá)77%[1]。臨床試驗(yàn)己經(jīng)證實(shí)非小細(xì)胞肺癌患者在完全切除術(shù)后接受輔助化療可以改善生存。目前,紫杉醇是NSCLC化療方案中的一線藥物，單藥對(duì)NSCLC的有效率為21%～24%[2]。本研究通過檢測紫杉醇聯(lián)合DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-dC)對(duì)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NCI-H446)增殖、遷移和侵襲能力的影響，初步探討5-Aza-dC作為化療增敏劑聯(lián)合紫杉醇在NSCLC化療中應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446細(xì)胞系來自中國醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室，細(xì)胞單層貼壁生長于含10%胎牛血清、NaHCO2濃度2 g/L、青霉素G濃度100 U/L、鏈霉素濃度100 μ g/L RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)5-氮雜-2'-脫氧胞苷為Sigma公司產(chǎn)品，紫杉醇注射液為美國百時(shí)美施貴寶公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)分組：(1)對(duì)照組：同期培養(yǎng)不加藥的NCI-H446細(xì)胞。(2)紫杉醇組：NCI-H446細(xì)胞加50 nmol/L紫杉醇培養(yǎng)72 h。(3)聯(lián)合用藥組：NCI-H446細(xì)胞加50 nmol/L紫杉醇及5 μ mol/L 5-aza-dC共同培養(yǎng)72 h。

1.3 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.3.1 NCI-H446細(xì)胞的增殖抑制率采用CCK-8法檢測藥物干預(yù)前后NCI-H446細(xì)胞的增殖抑制率變化。將處于對(duì)數(shù)生長期的NCI-H446細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。每孔含培養(yǎng)液100 μl，含細(xì)胞約2.5～3×104個(gè)。每孔加入10 μl CCK-8溶液(碧云天，上海，中國)作用2 h后，采用酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔的光密度值(OD)值。最后計(jì)算出紫杉醇(PAC)組和聯(lián)合用藥組對(duì)NCI-H446細(xì)胞的增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值計(jì)算增殖抑制率。增殖抑制率=[對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值進(jìn)行分析。

1.3.2 NCI-H446細(xì)胞遷移能力采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測藥物干預(yù)對(duì)NCI-H446細(xì)胞遷移的影響。分別于六孔板中的每孔中加入對(duì)數(shù)期生長的對(duì)照組、紫杉醇組和聯(lián)合用藥組NCI-H446細(xì)胞約5×105個(gè)細(xì)胞，加入血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁達(dá)到80%以上時(shí)，用無菌200 μl槍頭居中劃一傷痕。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去處劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于0、24 h計(jì)數(shù)并拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值進(jìn)行分析

1.3.3 NCI-H446細(xì)胞侵襲能力采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測藥物干預(yù)對(duì)NCI-H446細(xì)胞侵襲能力的影響。鋪Matrigel膠后選擇對(duì)數(shù)生長期的各組NCI-H446細(xì)胞消化后制成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后于Transwell小室上層小室內(nèi)每室分別加入細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定20 min，吉姆薩染色10 min。光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)計(jì)數(shù)穿過小室底膜的細(xì)胞數(shù),評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移能力,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用Student's t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇及紫杉醇聯(lián)合5-aza-dC抑制NCI-H446細(xì)胞增殖CCK-8法檢測結(jié)果顯示，在24 h測對(duì)照組OD值為(1.774±0.113)，紫杉醇組為(1.717±0.327)，聯(lián)合用藥組為(1.698±0.282)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；在48 h測對(duì)照組OD值為(2.453±0.365)，紫杉醇組為(2.154±0.327)，聯(lián)合用藥組為(2.056±0.182)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，紫杉醇組及聯(lián)合用藥組較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在72 h測對(duì)照組OD值為(2.548±0.264)，紫杉醇組為(2.043±0.287)，聯(lián)合用藥組為(1.686±0.177)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，紫杉醇組及聯(lián)合用藥組較對(duì)照組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。其中藥物作用72 h計(jì)算紫杉醇組增殖抑制率為(19.8±0.134)%，聯(lián)合用藥組增殖抑制率為(33.8±0.151)%。兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。聯(lián)合用藥較單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇對(duì)NCI-H446細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖抑制作用，見圖1。

圖1 CCK-8法檢測各組藥物干預(yù)對(duì)NCI-H446細(xì)胞增殖的影響。

2.2 紫杉醇及紫杉醇聯(lián)合5-aza-dC均能抑制NCI-H446細(xì)胞遷移能力劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組依然具有較強(qiáng)的遷移能力，劃痕后24 h，劃痕處愈合率為(69.15±0.837)%，而在紫杉醇組劃痕處愈合率為(47.30±0.783)%，聯(lián)合用藥組劃痕愈合率為(43.45±0.862)%。結(jié)合對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，可以證實(shí)紫杉醇組及聯(lián)合用藥組均對(duì)NCI-H446細(xì)胞的遷移能力有影響。差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖2。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組藥物干預(yù)對(duì)NCI-H446細(xì)胞遷移能力的影響

2.3 紫杉醇及紫杉醇聯(lián)合5-aza-dC均能抑制NCI-H446細(xì)胞侵襲能力Transwell實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，24 h后，對(duì)照組NCI-H446細(xì)胞轉(zhuǎn)染穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量為(151.4±6.88)個(gè)，顯著高于紫杉醇組(66.8±5.17)個(gè)和聯(lián)合用藥組(40.2±4.55)個(gè)。這進(jìn)一步表明紫杉醇及紫杉醇聯(lián)合5-aza-dC可抑制NCI-H446細(xì)胞的侵襲能力(P＜0.01)。并且，紫杉醇聯(lián)合5-aza-dC較單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇對(duì)NCI-H446細(xì)胞有更強(qiáng)的抑制細(xì)胞侵襲的作用(P＜0.01)，見圖3。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組藥物干預(yù)對(duì)NCI-H446細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,國內(nèi)外學(xué)者對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行了大量基因水平的基礎(chǔ)研究，發(fā)現(xiàn)基因功能與表達(dá)模式異常是癌癥的主要特征。日益增多的研究表明，DNA甲基化(DNA methylation)、組蛋白修飾(Histone modification)、染色質(zhì)重塑(Chromatin remodeling)以及microRNAs介導(dǎo)的基因沉默等表觀遺傳調(diào)控方式的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。目前普遍認(rèn)為DNA異常甲基化是除缺失與突變外導(dǎo)致腫瘤抑制基因失活的第三種機(jī)制。有研究顯示腫瘤抑制基因發(fā)生甲基化是胃癌形成過程中的頻繁事件[4]。表遺傳調(diào)控易于修正的特性，使得表遺傳調(diào)控相關(guān)藥物成為腫瘤治療中的一個(gè)重要領(lǐng)域。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)在幾乎所有腫瘤細(xì)胞中都高度表達(dá)，各種腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)常處于高甲基化狀態(tài)，因此，基于DNMT抑制劑的藥物在臨床試驗(yàn)以及實(shí)驗(yàn)室研究中得到了廣泛重視。阿扎胞苷(5-azacytidine)、5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，DAC)等胞嘧啶類似物在DNA復(fù)制、RNA合成過程中能夠進(jìn)入核酸分子內(nèi)部，并以共價(jià)結(jié)合的方式與DNMTs相互作用，從而抑制核酸分子的甲基化，恢復(fù)各種腫瘤抑制基因的表達(dá)，從而達(dá)到治療腫瘤的作用[5]?；贒NMTs抑制劑的高效性，2004年美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration， FDA)首次批準(zhǔn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑阿扎胞苷(5'-azacytidine)用于治療骨髓異常增生綜合征，隨后又于2006年批準(zhǔn)5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)進(jìn)入骨髓異常增生的臨床治療[6]。但是，在實(shí)體瘤的治療應(yīng)用卻寥寥無幾，主要有兩方面原因：(1)5-Aza-2，-deoxycytidine藥物的半衰期極短，難以在實(shí)體瘤中形成有效的血藥濃度。(2)對(duì)實(shí)體瘤有效的濃度往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的全身毒副作用。這正是表遺傳學(xué)調(diào)控相關(guān)藥物在實(shí)體瘤中的應(yīng)用瓶頸。如何使表遺傳學(xué)調(diào)控相關(guān)藥物能夠與化療藥物完美的結(jié)合使化療藥物發(fā)揮最大效果是表遺傳學(xué)治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

本研究中，我們利用可以將5-Aza-2，-deoxycytidine短期、小劑量的應(yīng)用于人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446，達(dá)到降低肺癌細(xì)胞抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，提高抑癌基因的表達(dá)水平，起到對(duì)化療藥物增敏的作用，同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用紫杉醇，提高紫杉醇對(duì)NCI-H446細(xì)胞在增殖、遷移、侵襲方面的抑制作用。類似的研究還有Cheetham等[7]的研究證實(shí)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中應(yīng)用5-Aza-2，-deoxycytidine聯(lián)合5-氟尿嘧啶可以提高結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性，達(dá)到更好的化療效果。Hu等[8]的研究也證實(shí)5-Aza-2，-deoxycytidine可以提高子宮內(nèi)膜癌對(duì)激素治療的敏感性。

然而，表遺傳治療方法在實(shí)體腫瘤中的臨床應(yīng)用依然還有很長的路要走。腫瘤組織中通常同時(shí)存在多種表遺傳調(diào)控的變化，單一使用一種抑制劑很難從根本上改善腫瘤患者的癥狀。與此同時(shí)，由于表遺傳調(diào)控幾乎參與生物體內(nèi)所有的生物學(xué)過程，各種修飾酶的作用也特別廣泛，各種抑制劑的使用也會(huì)帶來意想不到的副作用[9]。此外，各類抑制劑在個(gè)體內(nèi)的穩(wěn)定性較差、藥物代謝時(shí)間較短也是影響其使用效果的一個(gè)重要原因[10]。因而，如何設(shè)計(jì)、開發(fā)高效穩(wěn)定，同時(shí)避免強(qiáng)烈副作用的表遺傳治療相關(guān)藥物成為表遺傳治療的關(guān)鍵問題。隨著腫瘤表基因組研究中的不斷深入，必然將揭示更多的尚未所知的表遺傳調(diào)控變化，從而為表遺傳調(diào)控相關(guān)藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用開辟新的方向。

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Inhibitory effect of Paclitaxel combined with 5-Aza-dC on non-small cell lung cancer cell line NCI-H446.

QU Hong-mei1,JIANG Yan-hui2,SUN Wei1,ZHU Xin-bing2.Department of Emergency1,Department of General Surgery2, Liaohe Oilfield General Hospital,Panjin 124010,Liaoning,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Paclitaxel(PAC)combined with DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2'-deoxycytidine(5-Aza-dC)on the proliferation,invasion and migration of on non-small cell lung cancer(NSCLC)cell line NCI-H446.MethodsNSCLC cell lines NCI-H446 were treated with PAC and 5-Aza-dC, and divided into three groups:control group,PAC group and combined group.NCI-H446 cell's proliferation ability was analyzed by CCK-8 assay,while the migration and invasion abilities were assessed by wound-healing assay and Matrigel invasion assay.ResultsCCK-8 assay indicated that NCI-H446 cells treated with PAC and 5-Aza-dC exhibited growth retardation.48 h after treatment,the proliferation ability of PAC group and combined group was significantly reduced compared with that of the control group(P＜0.01).24 h after wound formation,the wound healing rate of control group was(69.15±0.837)%,compared with(47.30±0.783)%in the PAC group and only(43.45±0.862)%in the combined group.TheseResultsshowed cell migration in PAC group and combined group was significantly reduced,compared with the control group(P＜0.01).Matrigel invasion assay showed that the numbers of cells penetrating Matrigel and adhering to the membrane in the control,PAC,and combined groups was(151.4±6.88),(66.8±5.17), (40.2±4.55),respectively,which indicated that cell invasion in PAC,and combined groups were significantly reduced (P＜0.01).Conclusion5-Aza-dC can enhance the chemosensitivity of NSCLC cell line NCI-H446 to PAC,and thus improve the chemotherapeutic effect of PAC for NSCLC.

Non-small cell lung cancer(NSCLC);5-Aza-dC;Paclitaxel;Chemosensitizer

R734.2

A

1003—6350（2014）21—3130—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.21.1229

2014-02-19)

曲紅梅。E-mail：zhuxinjiang55@126.com