張 飛 呂玲玲 萬傳星 張利莉*

放線菌一直是抗生素的重要來源。在放線菌中抗生素生物合成途徑已經(jīng)進(jìn)化了大約10億年，它的適應(yīng)性早就通過其穿透其它微生物并抑制其靶酶、大分子以及大分子結(jié)構(gòu)形成的能力表現(xiàn)出來，因此從放線菌中發(fā)掘新的抗生素一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，目前臨床上應(yīng)用的抗生素約三分之二來源于鏈霉菌屬［1－2］。普通環(huán)境的放線菌中發(fā)現(xiàn)新型抗生素越來越困難，人們逐漸把目光轉(zhuǎn)移到其他環(huán)境，特別是對海洋和極端環(huán)境中放線菌的深入研究，認(rèn)為極端環(huán)境中的放線菌具有發(fā)現(xiàn)新型抗生素的巨大潛能［3］。嗜鹽放線菌是極端微生物的重要組成部分，它們通常生活在鹽湖、鹽堿地、海水等高鹽環(huán)境中，是一類極具應(yīng)用前景的微生物資源［4］。Kokare等人發(fā)現(xiàn)的嗜鹽放線菌株AH1可以抑制細(xì)菌Staphylococcus aureus、Staphylococcus 。epidermidis和Bacillus subtilis的生長［5］。新疆鹽堿環(huán)境蘊(yùn)藏著豐富的嗜鹽放線菌，具有發(fā)現(xiàn)新型抗生素的巨大潛能。

抗生素篩選模型有傳統(tǒng)篩選模型、特定篩選模型以及高通量篩選模型，傳統(tǒng)篩選模型被稱為是抗生素產(chǎn)生菌與活性物質(zhì)的雙重篩選，其樣品為菌株發(fā)酵液或發(fā)酵液粗提物，成分復(fù)雜，篩選過程耗時(shí)長，效率較低，且有一定盲目性［6］。然而隨著基因組研究的深入，各種基因工程手段，遺傳學(xué)手段以及分子細(xì)胞學(xué)方法的出現(xiàn)，使得天然來源的新抗生素的篩選技術(shù)，已經(jīng)逐漸從隨機(jī)篩選程序向“定向篩選”轉(zhuǎn)變。本研究以經(jīng)典篩選方法為依據(jù)，以分離于新疆鹽環(huán)境放線菌為供試菌，在實(shí)驗(yàn)室對新疆鹽環(huán)境放線菌研究的基礎(chǔ)上，選取攜帶有NRPS基因的放線菌，對發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性篩選，以期得到具有抗生素產(chǎn)生潛能的放線菌。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

儀器:旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Eyela，日本)，恒溫培養(yǎng)箱(Boxun，上海)，移液器(Eppendorf)，搖床(Boxun，上海)，高速臺式離心機(jī)(Gl－20G－Ⅱ，上海安亭科學(xué)儀器廠)，超凈工作臺(Boxun，上海)。

試劑:石油醚，氯仿，乙酸乙酯，甲醇均為國產(chǎn)分析純試劑，購于天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

供試菌:48株供試菌由本實(shí)驗(yàn)室提供，均為耐鹽菌(1% ～15%)，包括輕度和中度嗜鹽菌。其中輕度嗜鹽菌7株，中度嗜鹽菌25株，極端嗜鹽16株。

靶標(biāo)菌:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus pidermidis ATCC35984)分別由浙江醫(yī)學(xué)院和上海復(fù)旦大學(xué)提供，大腸桿菌(Escherichia coli7－5)由塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院提供。白色念珠菌株標(biāo)準(zhǔn)菌 Candida albican ATCC64550，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，白色念珠菌臨床株:Candida albican 09－1555，Candida albican 09 －1634，Candida tropicalis 032，Candida krusei09－1681，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院提供，分別分離于陰道、糞便、咽喉拭子等部位。

1.3 培養(yǎng)基

ISP－4培養(yǎng)基:淀粉 10.0 g，(NH4)2SO44.0 g，CaCO31.0 g，MgSO42.0 g，K2HPO42.0 g，瓊脂18.0 g，Nacl 1.0 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0 ～7.5。

SDA 培養(yǎng)基:葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂20.0 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0。

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 18.0 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.5。

TSB 培養(yǎng)基:TSB 30.0 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.5。

玉米粉培養(yǎng)基:每升水含玉米粉15.0 g(煮沸20 min，四層紗布過濾用其濾液)，葡萄糖 10.0 g，CaCO31.0 g，NaCl(根據(jù)不同菌株最適鹽濃度添加)，蛋白胨 5.0 g，H2O 1 000 mL，pH 7.5，121 ℃，高壓蒸汽滅菌30 min。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試放線菌發(fā)酵液的制備

先將供試放線菌涂布于ISP－4固體培養(yǎng)基上，涂布量為每板35μL。37℃恒溫培養(yǎng)數(shù)日，待菌株長出。將長出的菌體再次接種到液體ISP－4培養(yǎng)基中37℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)4 d制成種子液。然后將種子液接種到玉米粉培養(yǎng)基中，接種量為2 mL/200 mL，37℃，180 r/min震蕩培養(yǎng) 7 d得到發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min得上清液。

2.2 發(fā)酵液的萃取與生物活性測試

將處理過的發(fā)酵液按1:1的體積比乙酸乙酯萃取三次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后得到乙酸乙酯相和水相，水相干燥后再次用甲醇超聲溶解，減壓濃縮后得到甲醇相。甲醇相用“M”表示，乙酸乙酯相用“E”表示，4℃冰箱保存待用(過程如下)。

圖1 不同菌株發(fā)酵液兩種萃取相對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

圖2 不同菌株發(fā)酵液兩種萃取相對表皮葡萄球菌的抑菌效果

圖3 菌株發(fā)酵液甲醇萃取相對大腸桿菌抑菌效果

3 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)測定了48株攜帶NRPS基因的嗜鹽放

2.3 抗菌活性測試方法

圖4 不同菌株發(fā)酵液兩種萃取相對白色念珠菌的抑菌效果

牛津杯法又稱管蝶法［7］。以金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，大腸桿菌和白色念珠菌為靶標(biāo)菌。將靶標(biāo)菌接種于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中:金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌接種于液體TSB培養(yǎng)基中，大腸桿菌接種于液體LB培養(yǎng)基上，念珠菌接種于液體SDA培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h獲得靶標(biāo)菌菌懸液，取35μL菌懸液分別涂布于相應(yīng)固體培養(yǎng)基平皿上，制成靶標(biāo)菌指示平皿，每種靶標(biāo)菌設(shè)置3個(gè)重復(fù)，將滅菌的牛津杯輕輕放入制好的指示平皿上。再將甲醇相和乙酸乙酯相萃取物配制成0.1 g/mL的稀釋液，然后每個(gè)杯中加入200μL稀釋液，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，測量抑菌圈，計(jì)算平均值［8］。線菌發(fā)酵液的抑菌活性，并從中篩選出18株活性菌株，其中抗金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的有15株(圖1－2)，抗大腸桿菌的有3株(圖3)，抗白色念珠菌的有11株(圖4);18株拮抗菌中放線多孢菌(Actinopolyspora)9株， 擬諾卡氏菌(Nocardiopsis)5株，鏈霉菌(Streptomyces)4株(表1)，均為新疆嗜鹽放線菌的優(yōu)勢菌群。18株拮抗菌中有13株菌的最適鹽濃度在5% ～10%之間，屬于中度嗜鹽菌，其中Actinopolyspora 7株，Nocardiopsis 4株，Streptomyces2株，3株輕度嗜鹽菌和2株極端嗜鹽菌。18株拮抗菌有16株含有兩種以上抗生素合成基因。

從圖1可以看出抗金黃色葡萄球菌的菌株發(fā)酵液活性部位不僅存在于甲醇萃取相也在于乙酸乙酯萃取相。13株抗金葡菌的拮抗菌中，甲醇相有抗性的有2株分別為TRM 45542和TRM 46033;乙酸乙酯相有抗性的有7株;甲醇相和乙酸乙酯相都有抗性的有3株。圖2顯示在抗表葡菌的8株拮抗菌中，有5株菌的活性部位在乙酸乙酯相中，2株菌兩相都對表葡菌有抗性。圖3顯示的是3株菌對大腸桿菌的抗菌效果，這3株菌中只有甲醇相的發(fā)酵液萃取相對大腸桿菌有抑菌作用。圖4是10株菌發(fā)酵液兩種萃取相對白色念珠菌的抑菌效果，除菌株TRM 45301外其余9株菌的活性部位都在甲醇相。

攜帶NRPS功能基因的菌株都有抗革蘭氏陽性菌和真菌的潛能，原因是NRPS基因能調(diào)控放線菌產(chǎn)成多肽類抗生素，如青霉素、萬古霉素和環(huán)孢菌素A等，這些多肽類抗生素大多以環(huán)化為主，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定功能特殊，在抗G+特別是抗耐藥菌上發(fā)揮著巨大的作用，比如萬古霉素是抗MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)的首選藥物［9－11］。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明攜帶有NRPS基因的菌株的抑菌幾率只占到34.6%，另外的63.4%未能表達(dá)出抑菌活性，可能是發(fā)酵過程中未能激發(fā)出功能基因的表達(dá)，導(dǎo)致了基因沉默。也有可能是NRPS基因在表達(dá)時(shí)有底物選擇性，而所用的發(fā)酵培養(yǎng)基未能提供這些底物，導(dǎo)致其不能產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物［12］。在所有活性菌株中含有兩種以上功能基因的菌株有16株，其中以含有PKS－Ⅰ和NRPS的菌株居多，因此從含有兩種以上抗生素合成基因的菌株中篩選活性菌株的幾率比含有一種基因的幾率高。

功能菌株發(fā)酵液的抑菌部位不僅存在于甲醇萃取相也在于乙酸乙酯萃取相，抑菌部位在乙酸乙酯萃取相中的菌株較甲醇相多，所以可以用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液的方法對菌株活性成分進(jìn)行分離純化，從嗜鹽菌的最適鹽濃度發(fā)現(xiàn)，拮抗菌大部分都屬于中度嗜鹽菌，拮抗菌半數(shù)的放線多孢菌是中度嗜鹽菌，可見在新疆嗜鹽放線菌的抑菌篩選中，鏈霉菌并非是主要的的菌株來源，攜帶有抗生素合成基因的嗜鹽放線多孢菌篩選幾率更大。

表1 18株拮抗菌的種屬及抗生素合成基因信息

續(xù)表1 18株拮抗菌的種屬及抗生素合成基因信息

［1］ 饒以群.從放線茵發(fā)現(xiàn)抗生素的振興［J］.國外醫(yī)藥抗生素分冊，2010，31(6):261 －265.

［2］ 李歐，繆克排.鏈霉菌次級代謝研究進(jìn)展［J］.中國抗生素雜志，2005，30(11):695 －697.

［3］ 馬寅姣，宋沁馨，顧覺奮.抗生素篩選方法［J］.中國抗生素雜志，2010，35(9):654 －658.

［4］ Kokare CR，Mahadik K R，et al.Isolation，characterization and antimicrobial activity of marine halophilic Actinopolyspora species AH1 from the west coast of India［J］.Current Science.2004，86(4):593－596.

［5］ 張永光，李文均，姜成林，等.嗜鹽放線菌的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)雜志，2002，22(4):45 －47.

［6］ 展麗然，張克誠，冉隆賢，等.農(nóng)用抗生素篩選模型的發(fā)展概述［J］.微生物學(xué)雜志，2008，28(6):91 －93.

［7］ 錢存柔，黃儀秀.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京大學(xué)出版社，2000:207－208.

［8］ Diao W R，Hu QP，F(xiàn)eng SS，et al.Chemical Composition and Antibacterial Activity of the Essential Oil from Green Huajiao(Zanthoxylum schinifolium)against Selected Foodborne Pathogens［J］.Agricultural and Food Chemistry.2013，61(25):60446049.

［9］ Li J.Zhao G Z，Chen H H，et al.Antitumour and antimicrobial activities of endophytic streptomycetes from pharmaceutical plants in rainforest［J］.Letters in Applied Microbiology，2008，47(6):574-580.

［10］ 張學(xué)成，張惠.多肽類生物活性物質(zhì)的非核糖體合成機(jī)理［J］.青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué))，2010，15(1):389－394.

［11］ 王世媛.非核糖體肽合成酶(NRPSs)作用機(jī)理與應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)報(bào)，2007，47(4):734－737.

［12］ Lautru S，Gregory L.Challis Substrate recognition by nonribosomal peptide synthetase multi－ enzymes［J］.Microbiology，2004，150(6):1629-1636.