姜項福 劉文杰，2 白紅進，2*

甘草是豆科(Leguminosae)甘草屬(Glyeyrrhiza)，在許多國家都有分布，而甘草屬植物總共有20種，僅在中國就分布達12種，其中新疆占了9種。甘草曾廣泛分布西北部各地區(qū)，不過由于人為的原因，原主產(chǎn)甘草的山西、陜西、山東及東北三省，現(xiàn)已絕跡或分布甚少，現(xiàn)在能提供野生商品藥材的省區(qū)僅內(nèi)蒙古、新疆、寧夏、甘肅、青海和陜西的榆林地區(qū)等，而以新疆蘊藏量較多，種質(zhì)資源也最豐富。根據(jù)2000年版《中華人民共和國藥典》中記載，甘草的原植物有3種，即烏拉爾甘草、脹果甘草和光果甘草三種。在我國，甘草作為一種中藥材，已有2 500多年治療疾病的歷史，現(xiàn)在隨著對甘草研究的進一步發(fā)展，其已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域。甘草中含有甘草酸、甘草甙、甘草類黃酮、生物堿等多種生物活性成分，其中，甘草酸和甘草類黃酮等是最重要的活性成分。研究表明，甘草酸具有如抗炎、解毒、保肝等功效，甘草酸以及甘草酸注射劑，可用于治療慢性乙型、丙型肝炎，戊型肝炎等，效果不錯［1－2］;它可以應(yīng)用于改善上呼吸道感染的癥狀［3］;在SARS病毒廣泛流行的時候，也有人把甘草酸應(yīng)用到 SARS 臨床治療的報導(dǎo)［4］;Chan 等［5］發(fā)現(xiàn)甘草酸能對黃曲霉素B1誘導(dǎo)的細胞毒有較好的保護作用;范明浩［6］在研究中發(fā)現(xiàn)甘草酸也能直接抑制與哮喘相關(guān)的炎癥細胞，很好地控制哮喘的發(fā)病癥狀。甘草黃酮是一類成分復(fù)雜的混合物，目前已知成分達150多種，單體提取非常困難，所以通常的甘草黃酮實際為黃酮類化合物的混合物。對甘草黃酮的研究也表明，甘草黃酮具有明顯的清除自由基以及抑制腦組織脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的作用［7］;甘草黃酮有較強的抑制酪氨酸酶活性和黑素生成的作用，同時對黑素細胞的細胞毒性較低，是較為安全有效的美白藥物［8］;蔡云清等［9］在研究中發(fā)現(xiàn)，甘草黃酮能誘導(dǎo)肝癌SMMC－7721細胞凋亡，可抑制SMMC－7721細胞增殖，并呈時間劑量效應(yīng)。

細胞是生命體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，細胞研究是揭示生命的奧秘和征服疾病的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)之一?？疾旒毎男螒B(tài)變化、功能變化和周圍生化環(huán)境的變化，可加深了解細胞的生理過程，這對生命科學(xué)自身的發(fā)展和生物醫(yī)藥、分析技術(shù)和材料科學(xué)等的進步都將有重要的促進作用。電化學(xué)方法是分析化學(xué)領(lǐng)域中一種經(jīng)典的分析測試方法，具有效率高、耗費低(儀器和試劑均價格較低)、毒性小和重現(xiàn)性好等優(yōu)點，在各種細胞研究中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。目前報導(dǎo)的應(yīng)用較多的電化學(xué)方法，主要有細胞的伏安法檢測［10－12］、阻抗法檢測［13－14］、掃描電化學(xué)顯微鏡法檢測［15－16］等。相比較于通常的細胞毒實驗方法，如MTT染色法，熒光法以及透射電鏡觀察法等，雖然實驗的結(jié)果比較令人滿意，但是有的方法所用試劑毒性較大，對人具有很強的致癌性，而有的方法所用到的儀器價格昂貴，缺乏廣泛的應(yīng)用性。電化學(xué)方法的引入，無疑是對細胞研究領(lǐng)域的促進和發(fā)展，有著很重要的意義。

實驗通過以肝腫瘤細胞HepG－2為體外研究模型，利用ITO導(dǎo)電玻璃具有良好的透光性能和導(dǎo)電性能，自制了一組工作電極，借助電化學(xué)方法和顯微鏡觀測等手段，評估了甘草酸和甘草黃酮對腫瘤細胞的細胞毒性的影響。甘草酸作為一種比較常見的天然產(chǎn)物成分，已經(jīng)在醫(yī)療和衛(wèi)生保健領(lǐng)域展現(xiàn)出了很大的應(yīng)用前景。通過各方面的研究，若是能充分利用新疆的這些特色的優(yōu)質(zhì)的甘草資源，積極開發(fā)出其最大的應(yīng)用價值，使之廣泛應(yīng)用到新穎的保健、防癌抗癌藥物的開發(fā)和研制中，對經(jīng)濟、社會發(fā)展都將產(chǎn)生非常重要的意義。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

光透性氧化銦錫導(dǎo)電玻璃(ITO)購自深圳南玻技術(shù)有限公司，厚1.1 mm，涂層為78.5±1.5 m的氧化銦錫薄層，熱阻為20.6±2.5Ω/cm2，手動切割成1.5 cm×1.5 cm的薄片。

電化學(xué)實驗均是使用CHI 660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司，中國)進行，采用常見的三電極系統(tǒng)檢測。其中自制的ITO導(dǎo)電玻璃電極作為工作電極，參比電極和對電極分別為飽和甘汞電極(SCE)和鉑電極。所有電化學(xué)測試均在室溫下進行。

使用倒置光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯 CKX41，日本)觀察了細胞的生長形態(tài)，并通過連接于顯微鏡上的數(shù)碼相機(奧林巴斯CKX41，日本)對細胞進行拍照。

人肝癌細胞HepG2購自中科院上海細胞庫，培養(yǎng)基為添加了10%新生牛血清的RPMI1640，實驗中使用的緩沖溶液為pH=7.4的磷酸緩沖溶液(PBS，1.56 g/L Na2HPO4· H2O +0.20 g/L KH2PO4+8.00 g/L NaCl+0.20 g/L KCl)。

甘草酸和甘草黃酮的測試樣品由塔里木大學(xué)塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室提供。

實驗中所用的試劑均為分析純，配制試劑的如無特殊說明均為蒸餾水。

1.2 ITO工作電極的制作

首先用洗滌劑仔細清洗氧化銦錫導(dǎo)電玻片(ITO)，浸于丙酮中置于超聲儀中超聲兩次，每次5分鐘。然后用超純水清洗，并在超純水超聲5分鐘。用氮氣流干燥后，將ITO導(dǎo)電玻片放入高壓高溫蒸汽中滅菌30分鐘，最后于烘箱中60℃條件下干燥待用。

用702白硅膠將切割好的5 mL塑料離心管管身(高度3 cm，內(nèi)徑2 cm)與已滅菌的ITO導(dǎo)電玻片粘貼好制成細胞培養(yǎng)池，再將5個同規(guī)格的培養(yǎng)池以硅膠固定在挖有圓孔的硬質(zhì)塑料板上，分別標(biāo)記為1、2、3、4、5號。用導(dǎo)電膠將銅導(dǎo)線與ITO導(dǎo)電玻片連接，測試其導(dǎo)電性，然后用環(huán)氧樹脂作為絕緣體覆蓋其余部位，做成實驗所用的細胞培養(yǎng)池及電化學(xué)工作電極。如圖1所示。

圖1 自制ITO導(dǎo)電玻璃電極示意圖

1.3 細胞培養(yǎng)與傳代

培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶先放置于37℃的恒溫水浴鍋中預(yù)熱，打開紫外燈照射超凈工作臺30分鐘。用75%酒精噴灑雙手消毒，并擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺。點燃酒精燈，準(zhǔn)備好吸量管和預(yù)熱好的培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶(取出時均需以酒精消毒試劑瓶)待用。從培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2，濕度95%)內(nèi)取出細胞，在顯微鏡下觀察細胞生長情況后置于超凈工作臺中。將原培養(yǎng)液倒入廢液缸中，取適量PBS清洗三次。加入1.5 mL胰蛋白酶消化液，在倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度，立刻倒棄消化液并加入2～3 mL培養(yǎng)基停止消化。接著用吸量管輕柔地吹打成細胞懸液全部轉(zhuǎn)移至離心試管，離心分離5分鐘。棄去上清液，加入2～3 mL培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打細胞再次制成細胞懸液。取1/3體積的細胞懸液轉(zhuǎn)移至一個新的培養(yǎng)瓶，添加8～10 mL培養(yǎng)基，搖勻后將培養(yǎng)瓶(瓶蓋不能擰緊，以免細胞缺氧)置于CO2培養(yǎng)箱中讓細胞貼壁生長。剩余細胞計數(shù)后加適量數(shù)目到自制電極中培養(yǎng)，作為電化學(xué)測試對象。

1.4 細胞測定

將五個培養(yǎng)池置于紫外線下消毒30分鐘后用PBS清洗三次，在每個培養(yǎng)池加入20 000個剛消化的Hep G2細胞，補充培養(yǎng)基使溶液體積至1 000 μL。然后置于CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，此時細胞已經(jīng)粘附鋪展在ITO導(dǎo)電玻片電極表面，并處于對數(shù)生長期。此時，更換2 mL含有各種不同濃度的藥物(分別為1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 g/L 的甘草酸和甘草黃酮)的培養(yǎng)基，將細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時，取出電極，以PBS輕洗2～3次，進行細胞觀察拍照和電化學(xué)測量實驗。所有電化學(xué)實驗是在濃度均為1 mmol/L鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀探針溶液(其中含0.1 mol/L的KCl作為支持電解質(zhì))中以及室溫下進行。

2 結(jié)果和討論

2.1 甘草酸和甘草黃酮的電化學(xué)表征

分別把1.500 0 g淡黃色甘草酸粉末和1.500 0 g褐色甘草黃酮溶于100 mL容量瓶中，加入自制的pH=7.4的PBS緩沖溶液在超聲波作用下溶解并定容。然后分別吸取0.5 mL配制好的甘草酸溶液和甘草黃酮溶液至ITO電極，設(shè)置電化學(xué)工作站參數(shù)中的掃描速率為100 mV/s，對該兩種物質(zhì)進行電化學(xué)測試。

圖2 甘草酸(A)和甘草黃酮(B)在PBS中的電化學(xué)循環(huán)伏安圖。(掃描速率:100 mV/s)

從圖2(A)中可以看出，在中性條件下，甘草酸的循環(huán)伏安圖中，電勢范圍從－0.5 V～1.0 V，均無明顯的氧化還原峰的出現(xiàn)，而由圖2(B)可以看出，甘草黃酮在－0.4 V～0.6 V范圍內(nèi)也并無明顯的氧化還原峰電流出現(xiàn)?？紤]到實驗中用到的鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀氧化還原探針溶液在實驗中通常所設(shè)定的電勢范圍為－0.1 V～0.5 V之間，而在這個范圍內(nèi)，甘草酸和甘草黃酮均沒有明顯的氧化還原峰，所以實驗過程中有少量的藥品殘留也不會對測定的實驗結(jié)果產(chǎn)生明顯的干擾作用。

2.2 甘草酸和甘草黃酮對Hep G2細胞的生長抑制作用

細胞吞噬了一定量的藥物或者納米粒子，在這些外來物質(zhì)的刺激作用下，會產(chǎn)生細胞的凋亡現(xiàn)象，即體現(xiàn)出這些刺激物的細胞毒性。試驗中，分別加入了不同濃度的甘草酸和甘草黃酮，借助于電化學(xué)工作站和光學(xué)倒置顯微鏡，直觀的比較了甘草酸以及甘草黃酮對Hep G2細胞的細胞毒性大小，所得結(jié)果可見圖3和圖4。

圖3 (A)甘草酸，(B)甘草黃酮分別與細胞作用24小時后的循環(huán)伏安圖(實線圖1～4對應(yīng)濃度均分別是1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)。掃速為100 mV/s。探針溶液為含0.1 mol/L KCl支持電解質(zhì)的鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀(0.1 mmol/L:0.1 mmol/L)。

在以鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀探針溶液為電子媒介體的電化學(xué)測試中，工作電極的導(dǎo)電性能主要可以氧化還原峰電位的差值以及氧化還原峰型來評判。圖3(A)和圖3(B)中虛線CV圖是ITO電極在加了無藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時后在探針溶液中測量所得，其中最里邊虛線部分為加入了細胞的培養(yǎng)基所測得的CV圖，發(fā)現(xiàn)氧化峰和還原峰的峰－峰電位差分別達到了0.155 V和0.153 V，氧化峰電流分別為49μA和52μA;而最外邊的虛線部分則是加入了無細胞的培養(yǎng)基后所測得的CV圖，氧化峰和還原峰的峰－峰電位差分別為0.093 V和0.090 V，氧化峰電流分別為197μA和198μA。當(dāng)培養(yǎng)基加入到電極中48小時后，同時可以看到加入了細胞懸液的電極表面覆蓋了一層細胞之后，電極的峰電流明顯降低，峰－峰電位差顯著增大，這說明細胞在電極表面貼壁生長以及一些培養(yǎng)基中的有機蛋白質(zhì)分子吸附，大大阻礙了電極和探針溶液之間的電子傳遞，使得電極的導(dǎo)電性能顯著降低。

圖3(A)中實線CV圖為含不同濃度甘草酸的培養(yǎng)基與細胞作用24小時后測試所得，可以看到，隨著甘草酸濃度的增大，電極的峰－峰電位差減小，而峰電流逐漸增大。在濃度為1.0 g/L和1.5 g/L時，對應(yīng)于圖3(A)中的實線1和2，電極的氧化峰電流相比于無甘草酸時要有所增大，分別為55μA和63μA，但幅度較小，說明該濃度對細胞的生長抑制作用但并不明顯;而當(dāng)濃度增加到2.0 g/L和2.5 g/L時，氧化峰電流顯著增大，達到了101μA和150μA，說明細胞在該濃度的甘草酸作用下，凋亡數(shù)目大大增加，吸附在電極表面的細胞大大減少，使得電極和探針溶液之間的電子傳遞變得更為順暢。圖3(B)中實線CV圖為含不同濃度甘草黃酮的培養(yǎng)基與細胞作用24小時后測試所得，可以看到，在測試的濃度范圍內(nèi)，隨著加入的藥物濃度的增大，電極的峰－峰電位差也在逐漸減小，而峰電流也依次增大，但沒有明顯的突越變化，與圖3(A)比較即可以看出。這說明在該濃度范圍內(nèi)，細胞對甘草酸的刺激反應(yīng)比對甘草黃酮的反應(yīng)更加敏感，甘草酸對細胞的生長抑制效果也要優(yōu)于甘草黃酮。

通過數(shù)碼相機對細胞的數(shù)量變化進行了實時拍照，如圖4中所示。圖4(A1－A5)為細胞與不同濃度甘草酸的作用24小時后的照片。A1為未加甘草酸的對照圖，與A2～A5比較可以看到，隨著甘草酸的濃度增大，ITO電極表面的細胞數(shù)量逐漸減少，尤其從A3和A4的比較中可明顯看到電極表面細胞數(shù)量的變化，A5中細胞數(shù)量已經(jīng)比較稀少。這也印證了電化學(xué)測試的結(jié)果。圖4(B1～B5)為細胞與不同濃度甘草黃酮作用24小時后的照片。B1為對照圖，從B2～B5中可以看到，隨著甘草黃酮濃度增大，ITO電極表面的細胞數(shù)量逐漸減少，但并沒有出現(xiàn)顯著細胞數(shù)量的變化。這與電化學(xué)實驗結(jié)果也是一致的。

圖4 濃度均分別是0、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的甘草酸(A1～A5)，甘草黃酮(B1～B5)與細胞作用24小時后的照片。

結(jié)果表明，甘草酸和甘草黃酮都會對肝癌細胞Hep G2產(chǎn)生抑制殺傷作用，但在較低濃度時，甘草酸的抑制殺傷作用要更為顯著，并且有明顯的突越變化。

2.3 甘草酸對Hep G2細胞的抑制效率研究

通?？砂阉幬飳毎臍种菩?Inhibition Efficiencies，IE)定義為:

公式中I0是ITO電極中加入無細胞的培養(yǎng)基24小時后所測得的陽極峰電流值，I1和I2分別是培基中不含和含有藥物時，細胞培養(yǎng)48小時后所測得的陽極峰電流。公式中分母(I0－I1)表示細胞引起的電極電化學(xué)活性和導(dǎo)電性的降低;分子(I2－I1)則表示加入了藥物后對細胞的抑制效果。

通過同濃度的甘草酸和甘草黃酮對Hep G2細胞作用的效果表現(xiàn)，把甘草酸的濃度梯度范圍擴大，考察了其對腫瘤細胞的抑制效率，所得結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出在甘草酸濃度小于2.0 g/L時，其對Hep G2細胞的抑制作用較小，沒有超過20%;而當(dāng)濃度大于2.0 g/L時，抑制效率增幅明顯變大，達到了38%，當(dāng)濃度增大到4.0 g/L時，抑制效率增至76%，而通過顯微鏡觀測，見圖4(A)，可看到此時ITO電極上細胞存活的數(shù)量已經(jīng)很少。這也說明甘草酸在較大濃度時，對腫瘤細胞的殺傷效果已經(jīng)很顯著。但隨著濃度的繼續(xù)增大，其對細胞的抑制率變化幅度已經(jīng)很小，說明此時影響電極與氧化還原探針溶液的電子傳導(dǎo)已經(jīng)不是由于細胞的阻礙，而是培養(yǎng)基中大量的有機營養(yǎng)物質(zhì)吸附在電極表面造成了電子在探針溶液中的傳導(dǎo)不利。

在相同條件下做了三次平行實驗，由于細胞培養(yǎng)體系中成分的復(fù)雜性，相對偏差的范圍在6.0%－13.0%(見圖5)，說明本實驗采取的電化學(xué)檢測手段是可行的，基本達到了預(yù)期的目的。

3 結(jié)論

通過電化學(xué)循環(huán)伏安法以及光學(xué)顯微鏡觀測的方法，研究了甘草酸和甘草黃酮兩種天然產(chǎn)物與人肝癌細胞Hep G2的相互作用，發(fā)現(xiàn)甘草酸和甘草黃酮都能抑制Hep G2細胞的生長繁殖，并且其效率和培養(yǎng)基中的濃度相關(guān)，濃度越大，抑制率越高，呈現(xiàn)出相應(yīng)的濃度依賴性。其中甘草酸的細胞抑制效率較甘草黃酮要更強一些，當(dāng)甘草酸的濃度達到2.0 g/L時，其對細胞的生長抑制出現(xiàn)顯著提高，而甘草黃酮并沒有出現(xiàn)明顯變化。在接下來的工作中，應(yīng)該考慮把這幾種甘草的提取物與腫瘤細胞和正常細胞分別作用，考察其對不同細胞的作用是否會存在著特異性，以及對細胞體中小分子結(jié)構(gòu)和含量的影響。

圖5 不同濃度甘草酸對Hep G2細胞的抑制率

研究開發(fā)出一些低濃度、低毒高效的防癌抗癌藥物，一直是各國科學(xué)家和醫(yī)療專家的目標(biāo)，而已知的人工合成的化學(xué)抗癌藥物是很難達到要求，所以在近幾年，天然產(chǎn)物以及中草藥已經(jīng)成為藥物開發(fā)包括癌癥治療領(lǐng)域的一個備受關(guān)注且極具潛力的研究對象。通過本研究，希望能夠為新疆豐富的甘草資源的充分開發(fā)利用提供一些理論上的支撐。

4 致謝

實驗過程中得到了湖南師范大學(xué)國家重點實驗室譚亮副教授的很多幫助，同時也得到了基礎(chǔ)實驗樓無機實驗室洪遠新老師和分析實驗室的蔣卉老師的幫助，在此深表感謝。

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