賈晨光，李秀武，姚黎明*，劉建強(qiáng)，黃 俊，陳銀芳，張 雷

（1.河北省胸科醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050041；2.武漢海吉力生物科技有限公司，湖北 武漢 430075）

干擾素γ釋放試驗(yàn)診斷肺外結(jié)核的應(yīng)用價(jià)值

賈晨光1，李秀武1，姚黎明1*，劉建強(qiáng)1，黃 俊2，陳銀芳2，張 雷2

（1.河北省胸科醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050041；2.武漢海吉力生物科技有限公司，湖北 武漢 430075）

目的 比較干擾素γ釋放試驗(yàn)（interferon gamma release assay，IGRA）與結(jié)核菌染色涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)、結(jié)核菌素試驗(yàn)（tuberculin skin test，TST）在肺外結(jié)核診斷中的敏感性，探討IGRA方法在肺外結(jié)核中的應(yīng)用價(jià)值。方法 采集75例經(jīng)臨床診斷為肺外結(jié)核病患者的新鮮外周血，將IGRA檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法（結(jié)核菌染色涂片、結(jié)核菌染色涂片培養(yǎng)、TST）的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 75例肺外結(jié)核患者中，IGRA檢測(cè)陽(yáng)性率為84.0%，結(jié)核菌染色涂片（8.0%），結(jié)核菌培養(yǎng)（5.3%），TST檢測(cè)（52.0%），IGRA檢測(cè)陽(yáng)性率均明顯高于其他臨床常用檢測(cè)方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 IGRA試劑檢測(cè)法診斷肺外結(jié)核，敏感性明顯高于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

結(jié)核；干擾素γ釋放試驗(yàn)；診斷

目前結(jié)核的診斷方法較多，但檢測(cè)結(jié)果的敏感 性存在較大差距。特別是在肺外結(jié)核的臨床檢測(cè)上，該現(xiàn)象更為突出，主要原因之一就是肺外結(jié)核缺乏肺部病變的特點(diǎn)，病變的部位多隱匿，臨床癥狀不明顯［1］，且結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，敏感性低，以致臨床上經(jīng)常誤診和漏診。國(guó)內(nèi)目前肺外結(jié)核的診斷方法主要有影像學(xué)結(jié)合結(jié)核分枝桿菌涂片、培養(yǎng)及結(jié)核菌素試驗(yàn)（tuberculin skin test，TST）等。結(jié)

核分枝桿菌的涂片簡(jiǎn)單，但敏感性和特異性不高。結(jié)核菌培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，容易延誤病情的診治。TST是一種較古老的檢測(cè)方法，存在特異性不高等難以克服的缺陷。近年來(lái)，干擾素 γ釋放試驗(yàn)（interferon gamma release assay，IGRA）作為一種新型的檢測(cè)方法逐漸被各大醫(yī)院及檢驗(yàn)單位所接受。這類試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附和（或）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)方法定量檢測(cè)全血和（或）外周血單核細(xì)胞在結(jié)核桿菌特異性抗原刺激下釋放干擾素γ的水平，用于診斷結(jié)核分枝桿菌感染及結(jié)核病。該檢測(cè)方法及其相關(guān)試劑盒已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床，疾病預(yù)防控制中心為其制定了使用指南［2－3］。而且該方法在診斷活動(dòng)性結(jié)核方面具有很高的敏感性［4］。本研究對(duì)75例經(jīng)臨床影像學(xué)和組織學(xué)確診為肺外結(jié)核的患者進(jìn)行菌檢、TST及IGRA方法檢測(cè)，旨在探討各種方法在肺外結(jié)核診斷中的敏感性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2013年1—5月肺外結(jié)核病患者75例（河北省胸科醫(yī)院18例，武漢市醫(yī)療救治中心31例，北京老年醫(yī)院26例），均依據(jù)臨床表現(xiàn)、體征、細(xì)菌學(xué)、影像學(xué)、病理或抗結(jié)核治療有效明確診斷為肺外結(jié)核病，男性46例，女性29例，年齡18～67歲，平均（38.0±16.4）歲。其中結(jié)核性腦膜炎 7例，結(jié)核性腹膜炎10例，淋巴結(jié)結(jié)核5例，腎結(jié)核5例，關(guān)節(jié)結(jié)核16例，脊柱結(jié)核32例。

1.2 主要試劑及儀器：恒溫水浴鍋，結(jié)核菌純蛋白衍生物，抗酸染色液，結(jié)核桿菌培養(yǎng)基，結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒（武漢海吉力生物科技有限公司研制）。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)核菌染色涂片：取患者晨痰，均勻涂布于蓋玻片上（略厚），干燥固定后滴加石碳酸復(fù)紅染色8～10min，3%鹽酸酒精脫色1～2min，脫色時(shí)輕搖玻片，直到圖片顏色脫去為止，流水沖洗后用堿性美藍(lán)染液復(fù)染30s，流水沖洗，待干后用顯微鏡油鏡觀察細(xì)菌的染色性和形態(tài)。

1.3.2 結(jié)核菌培養(yǎng)：取患者晨痰，向痰標(biāo)本中加入1～2倍體積的 4%NaOH，渦旋振蕩 1min，靜置15min后取0.1mL處理標(biāo)本樣于培養(yǎng)基斜面，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，接種后3d、7d觀察，此后每周觀察1次，有菌落生長(zhǎng)后用抗酸染色驗(yàn)證，若同時(shí)為陽(yáng)性記錄為陽(yáng)性，否則為陰性，至第8周仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)記錄為陰性。

1.3.3 TST：取0.1mL藥液（含結(jié)核菌素純蛋白衍生物 5U）注射于受試者前臂掌側(cè)皮下，48～72h后檢查注射部位反應(yīng)，測(cè)量并記錄硬結(jié)的平均直徑，＜5mm者為陰性，5～15mm者為陽(yáng)性，＞15mm或者注射部位出現(xiàn)丘疹、水泡、潰爛、壞死者為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.3.4 IGRA檢測(cè)：受試者用BD肝素鋰抗凝采血管抽取5mL靜脈血，即刻輕柔顛倒混勻3～5次，使抗凝劑充分溶解。3h內(nèi)將采集的全血分裝到3種不同的培養(yǎng)管中，“T”為添加了結(jié)核特異性抗原ESAT-6、CFP-10的測(cè)試培養(yǎng)管，“N”為本底對(duì)照培養(yǎng)管，“P”為添加了非特異刺激原植物血凝素的陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)管，每種培養(yǎng)管分裝 1mL，分裝前需要顛倒混勻3次以上，分裝后輕柔顛倒培養(yǎng)管 5次并立刻置于 37℃培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)（22±2）h后取出，離心收集上清液，然后用雙抗體夾心法定量檢測(cè)上清中干擾素γ的含量，最后計(jì)算刺激培養(yǎng)系統(tǒng)中特異性升高的干擾素γ的量來(lái)判定是否為結(jié)核桿菌感染陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

IGRA、結(jié)核菌染色、結(jié)核菌培養(yǎng)、TST檢測(cè)肺外結(jié)核的陽(yáng)性率分別為 84.0%（63／75）、8.0%（6／75）、5.3%（4／75）、52.0%（39／75）。IGRA檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于其余3種方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 4種檢測(cè)方法診斷肺外結(jié)核的結(jié)果比較Table 1 The results of four test methods for extrapulmonary tuberculosis （n）

3 討 論

近年來(lái)結(jié)核病疫情呈明顯上升趨勢(shì)，全球所有傳染性疾病中，結(jié)核病已成為成年人的首要死因。我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，是世界上僅次于印度的第2結(jié)核病大國(guó)，中國(guó)第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示活動(dòng)性肺結(jié)核患病率為367／10萬(wàn)，菌陽(yáng)肺結(jié)核患病率為 160／10萬(wàn)，涂陽(yáng)肺結(jié)核患病率為 122／10萬(wàn)［5］。

肺外結(jié)核是指發(fā)生在肺部以外的全身其他臟器的結(jié)核病。國(guó)外資料顯示肺外結(jié)核占結(jié)核病的25%～30%，在中國(guó)占結(jié)核病的9.7%～11.8%，病死率占 14.1%～17.6%［6－7］。目前診斷肺外結(jié)核仍存在很多困難，主要原因是肺外結(jié)核變化大，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，缺乏特異性的表現(xiàn)。結(jié)核菌培養(yǎng)是診斷結(jié)核的可靠依據(jù)，但常規(guī)培養(yǎng)需要2個(gè)月的時(shí)間，快速培養(yǎng)也需要1周，而且陽(yáng)性率取決于采集標(biāo)本中細(xì)菌的數(shù)量。本研究中抗酸染色方法的陽(yáng)性率為8.0%（6／75），結(jié)核菌培養(yǎng)方法的陽(yáng)性率只有5.3%（4／75），可能與采集標(biāo)本的質(zhì)量有關(guān)；影像學(xué)作為輔助診斷方法，由于其使用的局限性，對(duì)肺外結(jié)核診斷存在較大困難；TST是臨床常用檢查結(jié)核的免疫學(xué)方法，雖然操作簡(jiǎn)單，觀察結(jié)果方便，但由于TST中使用的純蛋白衍生物的某些抗原成分與卡介苗和環(huán)境中的非結(jié)核分枝桿菌的抗原成分相同，易于發(fā)生交叉反應(yīng)，使得其有較高的假陽(yáng)性和假陰性，對(duì)臨床結(jié)核病的診斷意義不大。本研究中TST雖然比結(jié)核菌染色和結(jié)核菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率要高，但仍然很難滿足臨床診斷的需求。IGRA作為一種新的酶免疫檢測(cè)方法，其應(yīng)用的原理是，機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生特異性的效應(yīng) T淋巴細(xì)胞，其在體外再次受到結(jié)核菌特異性抗原的刺激時(shí)，會(huì)釋放干擾素γ，通過(guò)檢測(cè)干擾素γ的水平或計(jì)數(shù)分泌干擾素γ的數(shù)量，從而判斷機(jī)體是否感染結(jié)核分枝桿菌，輔助診斷結(jié)核病。由于 IGRA方法選擇的特異性抗原只存在于結(jié)核桿菌，且在是卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核桿菌中普遍缺失的RD1區(qū)基因片段所表達(dá)的蛋白，因此，IGRA方法檢測(cè)的陽(yáng)性率會(huì)明顯高于TST［8］。本研究中IGRA陽(yáng)性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他3種檢測(cè)方法。

篩選結(jié)核桿菌的潛伏感染是IGRA的主要應(yīng)用領(lǐng)域，但I(xiàn)GRA在肺外結(jié)核中的應(yīng)用相關(guān)報(bào)道卻不多，原因可能是肺外結(jié)核病例比較難收集。本研究75例患者是由全國(guó)在結(jié)核診斷方面有較好成就的3家醫(yī)院共同收集的，雖然病例數(shù)并不很多，還不能全面充分滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的要求，但本研究體現(xiàn)出來(lái)的IGRA技術(shù)優(yōu)越性，值得以后進(jìn)一步探索。在肺外結(jié)核的診斷中，痰結(jié)核桿菌檢測(cè)方法在診斷中出現(xiàn)了極大挑戰(zhàn)，一方面是因?yàn)榉瓮饨Y(jié)核活動(dòng)性結(jié)核的并發(fā)癥出現(xiàn)情況并不多，難以通過(guò)痰菌檢測(cè)來(lái)判斷；另一方面是因?yàn)樘稻鷻z測(cè)的檢出率本身并不高。目前肺外結(jié)核的主要輔助診斷技術(shù)為TST，但由于其接種抗原的選擇一直沿用年代較久的純蛋白衍生物，在應(yīng)用中存在明顯缺陷，因此急需進(jìn)行改良，而改良該技術(shù)可能會(huì)需要較長(zhǎng)時(shí)間，在這段時(shí)間里選出一種擁有較高敏感性的肺外結(jié)核診斷方法刻不容緩。

本研究結(jié)果表明IGRA方法是能夠滿足臨床應(yīng)用需求的，但考慮到檢測(cè)費(fèi)用較高的原因，推廣該方法可能還需要一定時(shí)間。

［1］YOON HJ，SONG YG，PARK WI，et al.Clinical manifestation and diagnosis of extrapulmonary tuberculosis［J］.Yonsei Med J，2004，45（3）：453－461.

［2］MAZUREK GH，JEREB J，LOBUE P，et al.Guidelines for using the QuantiFERON-TB gold test for detecting Mycobacterium tuberculosisinfection.United States［J］.MMWR Recomm Rep，2005，54（RR-15）：49－55.

［3］LALVANI A.Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century：new tools to tackle an old enemy［J］.Chest，2007，131（6）：1898－1906.

［4］DIEL R，LODDENKEMPER R，NIENHAUS A.Evidencebased comparison of commercial interferon-gamma release assays for detecting active TB：a metaanalysis［J］.Chest，2010，137（4）：952－968.

［5］全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2002，25（1）：3－7.

［6］SIU GK，ZHANG Y，LAU TC，et al.Mutations outside the rifampicin resistance-determining region associated with rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis［J］.J Antimicrob Chemother，2011，66（4）：730－733.

［7］SHARMA SK，MOHAN A.Extrapulmonary tuberculosis［J］.Indian J Med Res，2004，120（4）：316－353.

［8］AHMAD S.New approaches in the diagnosis and treatment of latent tuberculosis infection［J］.Respir Res，2010，11：169.

（本文編輯：趙麗潔）

VALUE OF INTERFERON-GAMMA RELEASE TEST IN DIAGNOSING EXTRAPULMONARY TUBERCULOSIS

JIA Chenguang1，LI Xiuwu1，YAO Liming1*，LIU Jianqiang1，HUANG Jun2，CHEN Yinfang2，ZHANG Lei2
（1.Department of Orthopedics，Hebei Chest Hospital，Shijiazhuang050041，China；2.Department of Wuhan Hygeianey Bioscience Co.Ltd，Wuhan430075，China）

ObjectiveTo compare the sensitivity of interferon gamma release test（IGRA）with suptum smear，sputum culture and tuberculin slcintest（TST）in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis.To investigate the value of IGRA method in extrapulmonary tuberculosis.MethodsFresh peripheral blood samples were collected from 75 patients of clinically diagnosed extrapulmonary tuberculosis.The result wascompared with those of traditional gold standard test methods（sputum smear and sputum culture，TST），and their clinical application value further were analyzed.ResultsIn 75casesof extrapulmonary tuberculosis，the positive rate by IGRA reagent test was 84.0%，sputum smear 8.0%，sputum culture 5.3%，TST test 52.0%.The positive rate of IGRA was significantly higher than those of other common methods，and the differences were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionIn the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis，the sensitivity of IGRA reagent is significantly higher than those of the traditional test methods，IGRA has a good clinical value.

tuberculosis；interferon-gamma release tests；diagnosis

R52

A

1007-3205（2014）10-1129-03

2014－06－04；

2014－08－22

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（12277754）

賈晨光（1975－），女，河北唐縣人，河北省胸科醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事骨科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：yaolm24＠126.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.004