張喜昌,費(fèi)世洲,常亞青,劉小林,王高學(xué)

(1.大連海寶漁業(yè)有限公司,遼寧 旅順 116045;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100;3.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023)

海參是一種名貴海產(chǎn)動(dòng)物,屬于棘皮動(dòng)物門(mén)(Echinodermata),是海參綱(Holothurioidea)動(dòng)物的泛稱(chēng)。我國(guó)范圍內(nèi)的海參有20種可以食用。品質(zhì)優(yōu)良的食用海參不僅肉質(zhì)軟嫩,營(yíng)養(yǎng)豐富,滋味腴美,風(fēng)味高雅,而且具有生精益腎,固元助本的藥用功效,是久負(fù)盛名的名饌佳肴。據(jù)《本草綱目拾遺》記載: 海參,味甘咸,補(bǔ)腎,益精髓,其性溫補(bǔ),足敵人參,故名海參?，F(xiàn)代研究表明,海參具有提高記憶力、延緩衰老、固本培元等功效。

海參中的具有極高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的品種——刺參(Apostichopus japonicus)一直以來(lái)就是八大海珍之一。刺參的蛋白質(zhì)含量在55 % 以上,并且脂肪含量極低,只有 1.85 %,氨基酸種類(lèi)全面,含量均衡,并且含有維生素B1,B2,B6,維生素A,維生素D,維生素E ,以及豐富的礦物元素,如Mn,Fe,Zn,Co,Se 等[1-2]。

隨著市場(chǎng)需求的激增,近年來(lái)刺參已成為我國(guó)最重要的海水養(yǎng)殖品種。但是,在養(yǎng)殖集約化程度不斷提高的過(guò)程中,水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化和刺參種質(zhì)資源逐步退化等原因,使刺參養(yǎng)殖的各個(gè)階段病害頻發(fā),嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展[3]。傳統(tǒng)的病害防治手段主要是使用抗生素及化學(xué)藥物。由于缺乏明確的藥物使用準(zhǔn)則,抗生素和化藥濫用、亂用的現(xiàn)象非常普遍,這些問(wèn)題進(jìn)一步導(dǎo)致了影響更為嚴(yán)重的耐藥性及藥物殘留等問(wèn)題,最終給水產(chǎn)品安全帶來(lái)嚴(yán)重的危機(jī)[4]。

尋找安全有效的防治刺參病害的方法,成為目前刺參養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的問(wèn)題。益生菌是一類(lèi)通過(guò)改善宿主腸道菌群生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用,從而提高宿主健康水平和健康狀態(tài)的活菌制劑。益生菌作為一種高效、安全的病害防治手段受到越來(lái)越多的關(guān)注[5]。目前在國(guó)內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的益生菌主要有光合細(xì)菌、拮抗菌、營(yíng)養(yǎng)和產(chǎn)消化酶菌群(乳酸菌、酵母菌等)以及改善水質(zhì)菌群(硝化細(xì)菌、反硝化菌等)。我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物益生菌大多來(lái)自于畜禽益生菌的簡(jiǎn)單移植,基于水產(chǎn)動(dòng)物本身的益生菌研究尚未大規(guī)模展開(kāi)。陸源益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖生物體內(nèi)難以定植,并且存在以下問(wèn)題: ①破壞水域環(huán)境中的微生態(tài)平衡;②利用效率低導(dǎo)致過(guò)度使用;③作為海水魚(yú)的主養(yǎng)模式——網(wǎng)箱養(yǎng)殖無(wú)法施加。所以,從水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)或其生存的天然環(huán)境中直接分離篩選高效、可定植益生菌的研究已經(jīng)得到越來(lái)越多的認(rèn)可。

益生菌在調(diào)節(jié)并維持機(jī)體腸道微生態(tài)平衡、幫助營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收等方面發(fā)揮著重要作用,Gate[6]認(rèn)為,健康動(dòng)物中正常的優(yōu)勢(shì)菌或次優(yōu)勢(shì)菌可以作為益生菌的來(lái)源。本研究以人工養(yǎng)殖的刺參和野生刺參為研究對(duì)象,采用純培養(yǎng)的方法分析刺參腸道微生物組成,并對(duì)刺參腸道細(xì)菌進(jìn)行了產(chǎn)酶試驗(yàn)分析,這對(duì)于刺參專(zhuān)用益生菌的研發(fā)具有十分重要的意義。益生菌必須滿足其施用對(duì)象的安全性要求,而溶血性檢測(cè)是體外檢驗(yàn)細(xì)菌安全性的一條有效途經(jīng),同時(shí)大規(guī)模的溶血性試驗(yàn),有助于我們正確認(rèn)識(shí)動(dòng)物腸道菌群與機(jī)體致病間的聯(lián)系。本文在分析刺參腸道微生物組成及產(chǎn)酶試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)初步篩選出的一批細(xì)菌(99株)進(jìn)行了溶血性檢測(cè),一方面為刺參益生菌的研發(fā)提供了參考,另一方面也為機(jī)體致病機(jī)理的研究提供一些數(shù)據(jù)資料。試驗(yàn)確定了 6株細(xì)菌作為刺參腸道潛在益生菌,為進(jìn)行刺參腸道益生菌的體內(nèi)篩選奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集健康的野生刺參和養(yǎng)殖刺參各30頭,其中野生刺參在 2011年10月由潛水員采自遼寧省旅順海域,平均體重40.6 g ± 0.5 g,平均體長(zhǎng) 10.1 cm ±1.0 cm;養(yǎng)殖刺參由遼寧省大連海寶漁業(yè)有限公司提供,平均體重32.1 g ± 0.5 g,平均體長(zhǎng)7.6 cm ± 1.0 cm。

1.2 腸道菌的培養(yǎng)、分離和純化

試驗(yàn)設(shè)置 4個(gè)處理組,分別為養(yǎng)殖刺參之腸壁組、內(nèi)容物組和野生刺參之腸壁組、內(nèi)容物組。腸道菌的培養(yǎng)、分離和純化,參照Sawabe等[7]方法,先用75 % 酒精沖洗實(shí)驗(yàn)刺參體表,在無(wú)菌條件下,用剪刀剪開(kāi)刺參體腔,取出刺參消化道,用 0.9 % 生理鹽水沖洗腸道外壁,擠出腸道內(nèi)容物。將采集的養(yǎng)殖和野生刺參的腸道內(nèi)容物和腸壁分別置于無(wú)菌試管中,稱(chēng)重后,分別置于研缽內(nèi),用 5 mL無(wú)菌生理鹽水充分研磨為均勻樣品。用無(wú)菌生理鹽水對(duì)樣品進(jìn)行倍比稀釋至 10–6,各稀釋度樣品均用旋窩振蕩器震蕩均勻。選取合適濃度梯度,分別取100 μL涂布2216E平板,每個(gè)濃度下設(shè)置 3個(gè)重復(fù),28℃條件下培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)后選菌落生長(zhǎng)分布均勻的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。選擇細(xì)菌菌落數(shù)在30～300的平板,隨機(jī)挑取40個(gè)單菌落并編號(hào),在2216培養(yǎng)基上多次劃線分離純化,直到得到純種菌株為止。將得到的純種菌株保存于–80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)菌鑒定

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒(Bioteke)提取單克隆菌株的DNA作為模板,分別擴(kuò)增16S rDNA基因片段,將PCR產(chǎn)物經(jīng)1 % 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,送往上海生工生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序,測(cè)序結(jié)果拼接后于NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast分析,并下載數(shù)株同代表菌株相似度高的菌株的16S rDNA序列,與代表菌株一同根據(jù)Clustal W方法進(jìn)行匹配排列,用MEGA 5.0軟件中的 Kimura 2－Parameter Distance模型以neighbourjoining分析法構(gòu)建得到系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),并進(jìn)行 1000次Bootstraps檢驗(yàn),最終得到分離菌株的菌屬信息。

1.4 產(chǎn)酶試驗(yàn)

將分離純化自刺參腸道的 224株細(xì)菌,分別點(diǎn)種于蛋白酶選擇培養(yǎng)基、淀粉酶選擇培養(yǎng)基和脂肪酶選擇培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)48 h。判定方法參照趙斌等[8]和馮雪等[9]。

三種培養(yǎng)基的制備:

蛋白酶選擇培養(yǎng)基: 酪蛋白 10 g,酵母膏 1 g,瓊脂16 g,人工海水1 000 mL;調(diào)pH至7.4;121.5 ℃下高溫滅菌20 min。

淀粉酶選擇培養(yǎng)基: 可溶性淀粉10 g,蛋白胨5 g,酵母膏1 g,瓊脂16 g,人工海水1 000 mL;調(diào)pH至7.4;121.5 ℃下高溫滅菌20 min。

脂肪酶選擇培養(yǎng)基: 蛋白胨10 g,吐溫–80 10 mL,CaCl2?7H2O 0.1 g,瓊脂 9 g,人工海水 1 000 mL;調(diào)pH至7.4;121.5 ℃下高溫滅菌20 min。

1.5 溶血性試驗(yàn)

將無(wú)菌的山羊血平板復(fù)溫至25 ℃后,挑選已活化的99株細(xì)菌接種于山羊血平板培養(yǎng)基上,于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h后觀察細(xì)菌的溶血能力。若菌落周?chē)霈F(xiàn)溶血環(huán),表明該細(xì)菌具溶血能力,是潛在的病原菌。若菌落周?chē)闯霈F(xiàn)溶血環(huán),表明該細(xì)菌無(wú)溶血能力。

2 結(jié)果

2.1 刺參腸道細(xì)菌數(shù)量

從 4個(gè)處理組的刺參腸道細(xì)菌培養(yǎng)平板中選取菌落分布均勻、生長(zhǎng)良好、數(shù)目在30～300的平板,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),由公式(各組每克樣品細(xì)菌數(shù)量=(5×10×稀釋倍數(shù)×單菌落數(shù)平均值)/樣品重量)計(jì)算出各組刺參腸道細(xì)菌數(shù)量(表1)。由表 1可知,實(shí)驗(yàn)各組刺參腸道細(xì)菌數(shù)量在(2.83～6.39)×107cfu/g,其中養(yǎng)殖和野生刺參腸道內(nèi)容物中細(xì)菌數(shù)量均比腸壁中細(xì)菌數(shù)量高出一倍左右。野生組刺參無(wú)論是細(xì)菌數(shù)量還是檢出的細(xì)菌種類(lèi)都較養(yǎng)殖組刺參高。

表1 各組腸道細(xì)菌含量統(tǒng)計(jì)(×107cfu/g )Tab.1 Content analysis of gut bacteria in different groups (×107cfu/g )

2.2 刺參腸道細(xì)菌組成

統(tǒng)計(jì)養(yǎng)殖刺參之腸壁組、內(nèi)容物組以及野生刺參之腸壁組、內(nèi)容物組的腸道菌培養(yǎng)平板上的菌落數(shù)量,其均值分別為 103、90、151、107。按 20%比例分別對(duì)各組培養(yǎng)平板上的菌落隨機(jī)取樣,進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。依據(jù)鑒定結(jié)果,統(tǒng)計(jì)每組的菌落中各屬細(xì)菌的菌落數(shù)量,得出每組的細(xì)菌組成比例,結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)各屬代表菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),見(jiàn)圖1～圖6。由表2可知,弧菌屬與假單胞菌屬為養(yǎng)殖和野生刺參共同的優(yōu)勢(shì)菌。希瓦氏菌是野生刺參的次優(yōu)勢(shì)菌,但在養(yǎng)殖刺參的腸壁中沒(méi)有檢測(cè)到該菌,只在其腸道內(nèi)容物中檢出。

2.3 產(chǎn)酶試驗(yàn)和溶血性試驗(yàn)

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可知,224株細(xì)菌中,同時(shí)具有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力的菌株24株;同時(shí)產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶的菌株45株,同時(shí)產(chǎn)淀粉酶、脂肪酶的菌株44株,同時(shí)產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的菌株39株;只產(chǎn)蛋白酶的菌株6株,只產(chǎn)脂肪酶的菌株1株,只產(chǎn)淀粉酶的菌株1株。224株細(xì)菌中的160株細(xì)菌具有產(chǎn)酶能力,所占比例為71.43 %,其中具產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力菌株分別為114株、114株、108株,所占比例分別為50.89 %、50.89 %、48.21 %。

表2 刺參腸道菌群組成比例(%)Tab.2 Proportion of gut bacteria of Apostichopus japonicas (%)

圖1 刺參腸道弧菌代表菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of representative strain for Vibrio among gut bacteria of Apostichopus japonicus

圖2 刺參腸道假單胞菌代表菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of representative strain for Pseudomonas among gut bacteria of Apostichopus japonicus

圖3 刺參腸道希瓦氏菌代表菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of representative strain for Shewanella among gut bacteria of Apostichopus japonicus

圖4 刺參腸道嗜瓊脂菌代表菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of representative strain for Agarivorans among gut bacteria of Apostichopus japonicus

圖5 刺參腸道氣單胞菌代表菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of representative strain for Aeromonas among gut bacteria of Apostichopus japonicus

圖6 刺參腸道芽孢桿菌代表菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of representative strain for Bacillus among gut bacteria of Apostichopus japonicus

溶血性試驗(yàn)結(jié)果顯示,挑選出的99株細(xì)菌中有23株具有溶血性,所占比例為23.23 %, 99株細(xì)菌中的39株具有產(chǎn)蛋白酶能力,在這39株細(xì)菌中共8株具有溶血性,所占比例為20.51 %。

2.4 刺參腸道潛在益生菌菌株的確定

綜合分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),確定了 6株細(xì)菌作為刺參腸道潛在益生菌,其都來(lái)自于野生組刺參之腸壁組,均同時(shí)具有蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力,除HS5(Bacillus)菌株外都為本組優(yōu)勢(shì)菌。其菌株信息如表3所示。

表3 刺參腸道潛在益生菌菌株信息Tab.3 Information of intestinal potential probiotic strains of Apostichopus japonicus

3 討論

刺參是我國(guó)北方海域最重要的養(yǎng)殖品種之一,尋找安全高效的手段解決刺參養(yǎng)殖中面臨的病害問(wèn)題,既是突破刺參養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展瓶頸的關(guān)鍵,也具有非常重大的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)效益,益生菌作為替代抗生素及化學(xué)藥物防治病害的重要手段,受到了越來(lái)越多的重視[3-5]。但目前從刺參腸道及其生活環(huán)境中篩選刺參專(zhuān)用高效益生菌的報(bào)道極少,而篩選刺參專(zhuān)用益生菌,有必要對(duì)刺參腸道微生態(tài)作全面的基礎(chǔ)研究。

關(guān)于益生菌篩選的方法論有許多,從健康動(dòng)物腸道中篩選可定植的優(yōu)勢(shì)菌或次優(yōu)勢(shì)菌是篩選益生菌的重要途經(jīng)[6];在本研究中, 以健康養(yǎng)殖刺參和野生刺參為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)各組刺參腸道細(xì)菌數(shù)量在 2.83×107～ 6.39×107cfu/g,試驗(yàn)結(jié)果與李彬等[10]、孫奕等[11]的結(jié)果相當(dāng)。無(wú)論是在細(xì)菌數(shù)量還是在細(xì)菌種類(lèi)上,野生組刺參都比養(yǎng)殖組刺參高,這與牛宇峰等[12]研究結(jié)果相似,而這一現(xiàn)象可能與刺參的習(xí)性有關(guān)——刺參在自然水域中以底質(zhì)表層泥沙中的硅藻、海藻碎片、腐殖質(zhì)、細(xì)菌等為食,相比于人工投餌的養(yǎng)殖環(huán)境,其攝取細(xì)菌的來(lái)源比較廣泛。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)無(wú)論養(yǎng)殖刺參還是野生刺參,其腸道內(nèi)容物和腸壁第一優(yōu)勢(shì)菌都為弧菌屬,所占比例在50 % 以上,次優(yōu)勢(shì)菌為假單胞菌,而孫奕等[11]僅報(bào)道野生刺參腸道內(nèi)容物中優(yōu)勢(shì)菌群為弧菌屬和假單胞菌屬。此次研究發(fā)現(xiàn)野生刺參第三優(yōu)勢(shì)菌為希瓦氏菌,并非牛宇峰等[12]研究結(jié)果中的芽孢桿菌。希瓦氏菌為海水中豐度較高的細(xì)菌,在很多水生動(dòng)物腸道內(nèi)及藻類(lèi)表面均有發(fā)現(xiàn)[13-15],而有研究表明,水域環(huán)境對(duì)魚(yú)類(lèi)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)具有顯著的影響[16],所以,水域環(huán)境的差異可能是造成刺參腸道菌群組成差異的根本原因。

動(dòng)物腸道中棲居著大量的微生物。從昆蟲(chóng)到人類(lèi)的各類(lèi)動(dòng)物都缺乏完整的酶系統(tǒng),均需依靠腸道微生物提供多種酶,才能完成其對(duì)食物的消化、營(yíng)養(yǎng)吸收以及生理代謝等功能,最終達(dá)到促生長(zhǎng)和增重的作用,因此,從健康動(dòng)物腸道中篩選具有良好產(chǎn)酶能力的菌株作為益生菌來(lái)源的研究也是一個(gè)熱點(diǎn)[17-19]。例如,馮雪等[9]探討了草魚(yú)和銀鯽腸道菌群的產(chǎn)酶能力,發(fā)現(xiàn)草魚(yú)和銀鯽腸道內(nèi)廣泛分布著具有產(chǎn)酶能力的細(xì)菌,認(rèn)為這些細(xì)菌分泌的胞外酶和宿主分泌的胞外酶一起參與了食物消化與營(yíng)養(yǎng)吸收過(guò)程。因此對(duì)刺參腸道菌群產(chǎn)酶能力的研究有助于我們對(duì)刺參營(yíng)養(yǎng)需求以及腸道益生菌篩選的分析。然而迄今為止,尚未見(jiàn)到關(guān)于刺參腸道產(chǎn)消化酶菌群的研究報(bào)道。由于蛋白質(zhì)、淀粉與脂肪為飼料三大營(yíng)養(yǎng)元素,而植物飼料中往往還具有大量的纖維素,所以一些研究學(xué)者將蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及纖維素酶作為分析腸道益生菌的主要依據(jù)[19]。于是我們研究分析了刺參腸道菌群關(guān)于這四種酶的產(chǎn)酶能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺參腸道中分布著大量產(chǎn)酶菌,并且產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶菌株比例大致相同。由此推測(cè),刺參對(duì)于三大營(yíng)養(yǎng)成分的需求量應(yīng)該一致,這就為我們?cè)O(shè)計(jì)刺參飼料配方以及選用飼料酶制劑類(lèi)相關(guān)產(chǎn)品提供了重要的參考依據(jù)。在本次研究中沒(méi)有檢測(cè)到具有產(chǎn)纖維素酶能力的菌株,而馮雪等[9]在草魚(yú)腸道內(nèi)檢出,我們分析,這可能與刺參來(lái)源食物中所含纖維素含量較低有關(guān)。許多研究表明,不同的物種其腸道內(nèi)產(chǎn)消化酶細(xì)菌的差異,往往與其生理特征及攝食習(xí)性有關(guān)[17-19]。

研究刺參專(zhuān)用益生菌是為了防治刺參養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)的嚴(yán)重病害問(wèn)題,而刺參腸道菌群溶血性與刺參疾病具有深刻的聯(lián)系[20-22]。楊嘉龍等[20]從患潰瘍病的養(yǎng)殖刺參的病灶處分離了 1株養(yǎng)殖刺參潰瘍病病原菌,經(jīng)鑒定為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種,并研究其溶血素活性,認(rèn)為該活性與此菌的致病性有關(guān)。研究表明,致病性氣單胞菌和弧菌分泌的胞外蛋白酶和溶血毒素是其主要的致病因子,事實(shí)上胞外蛋白酶并不直接致病,但它可將溶血毒素原降解成活性毒素,從而致病[21-22]。因此,具有產(chǎn)溶血素性能作為剔除致病菌和保留益生菌的重要篩選方法,能夠顯著加速益生菌篩選的進(jìn)程。在本次研究中,我們分析了99株細(xì)菌的溶血性,發(fā)現(xiàn)病原菌在菌群中所占比例等于具溶血性菌株在菌群中所占比例,如果將同時(shí)具有較強(qiáng)產(chǎn)胞外蛋白酶和溶血毒素能力的菌株視作機(jī)體病原菌,由此就可推測(cè)具溶血性細(xì)菌為機(jī)體潛在病原菌。將這些菌株視為刺參的潛在致病菌株予以剔除,可以縮小篩選工作量,為下一步進(jìn)行的潛在益生菌體內(nèi)篩選工作提供參考。

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