周 偉 ,何林文陸勤勤,朱建一,高 山 楊睿靈,楊 芳,王廣策

(1.中國科學(xué)院 海洋研究所 實驗海洋生物學(xué)重點實驗室,山東 青島 266071;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京,100049;3.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所,江蘇 南通,226007;4.常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常熟 215500;5.天津科技大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院 天津 300457)

紫菜(Porphyra)是一類原始紅藻,屬于紅藻門(Rhodophyta)紅藻綱(Rhodophyceae)紅毛菜亞綱(Bangiophycidae)紅毛菜目(Bangiales)紅毛菜科(Bangiaceae)紫菜屬(Porphyra)[1]。紫菜是世界上最重要的栽培海藻之一,目前我國的栽培物種包括長江以南的壇紫菜和長江以北的條斑紫菜,其中條斑紫菜的產(chǎn)值最高。

長期以來,對于光合作用研究主要集中在陸地高等植物,對于藻類方面的研究也大多集中在遺傳背景較清晰的海洋綠藻類等少數(shù)物種上,關(guān)于紅藻的光合作用研究報道較少。紅藻的光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與高等植物大不相同,例如,紅藻光系統(tǒng)Ⅱ的捕光色素系統(tǒng)主要由附著在類囊體膜上的藻膽體構(gòu)成[2-3],光合碳同化作用的關(guān)鍵酶 Rubsico大小亞基編碼基因均存在于葉綠體基因組中等[4]。另外,對于紅藻的光合作用研究也一直缺少較好的模式材料。紫菜生活史周期短、便于室內(nèi)培養(yǎng)、基因組小且減數(shù)分裂階段形成四分子等特點使其成為藻類尤其是紅藻光合作用研究的理想模式生物。

光合作用的基本反應(yīng)都是在類囊體膜上進行,這些反應(yīng)是由存在于PSⅠ、PSⅡ、Cytb6/f、ATPase這 4個復(fù)合物上幾百個蛋白完成的。這些蛋白除了負(fù)責(zé)把光能轉(zhuǎn)化為電能外,還有個別蛋白負(fù)責(zé) 4個復(fù)合物的組裝、固定與調(diào)節(jié)[5]。處于不同進化層次上的光合生物,其光合膜上的色素蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)、組成和功能并不完全相同。紅藻屬于最原始的真核藻類,其光合作用進化地位處于藍(lán)藻與高等植物之間的過渡類型,類囊體膜并不形成垛疊的基粒結(jié)構(gòu)[6]。研究探尋條斑紫菜類囊體膜上的蛋白組成與功能將對了解掌握紅藻的光合作用機制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1991年,Sch?gger等[7]為了研究哺乳動物和真菌線粒體中的蛋白質(zhì)復(fù)合物,建立了一種溫和膠電泳系統(tǒng),并稱之為 blue-native polyacrylamidegel electrophoresis(BN-PAGE).它可以真實地反映葉綠體蛋白質(zhì)復(fù)合物的情況,具有直觀、高效、方便的優(yōu)點和被廣泛應(yīng)用于同類蛋白質(zhì)組研究中的潛質(zhì)。該溫和膠電泳系統(tǒng)與其他溫和膠系統(tǒng)最明顯的區(qū)別就在于,電泳之前,考馬斯亮藍(lán)染液代替了陰極電極液,從而使電泳和染色得以同時進行,直觀而快速地反映了電泳的結(jié)果。在電泳時,結(jié)合葉綠素的蛋白質(zhì)復(fù)合物呈綠色,而不含葉綠素的呈藍(lán)色, 因此稱之為藍(lán)綠溫和膠電泳。作者以藍(lán)綠溫和膠電泳為工具,首次在國內(nèi)用于條斑紫菜類囊體膜色素蛋白質(zhì)復(fù)合物的研究。

1 材料與方法

1.1 材料來源

條斑紫菜葉狀體采自江蘇南通栽培海區(qū),取回實驗室后用消毒海水洗凈,陰干,凍存于?80℃待用。

1.2 材料組織破碎

將葉狀體放入高速組織搗碎機(上海標(biāo)本模型廠)中,加入預(yù)冷的類囊體膜提取緩沖液(50 mmol/L Tris,5 mmol/L EDTA,1 mmol/L MnCl2,1 mmol/L MgCl2,2 mmol/L NaNO3,100 mmol/L Sucrose,0.5 mmol/L K2HPO4,pH7.8)[8]。整個破碎過程在冰浴低光條件下進行。將葉狀體盡量攪碎,在顯微鏡下檢查碎片大小小于1 mm2。破碎后溶液經(jīng)篩絹過濾,去除細(xì)胞碎片,濾液于4℃避光保存。

1.3 超聲波破碎細(xì)胞

將濾液保持在低溫避光條件下進行超聲處理(JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎機,寧波新芝),超聲條件輸出功率100 W,工作時間5 s,間隙時間15 s,工作次數(shù)300次。

1.4 類囊體膜制備

將超聲后樣品進行超速離心30000 rpm,30 min,4℃(Beckman Coulter,SW 32 Ti rotor),所得沉淀即為類囊體膜粗制品。將沉淀保持在低溫避光條件下,加入不含蔗糖的類囊體膜提取緩沖液,充分研磨后重新懸浮。再進行蔗糖密度梯度離心,30000 r/min,4 h,4℃(Beckman Coulter,SW 32 Ti rotor),不連續(xù)蔗糖密度梯度從下至上為 70%,60%,50%,40%,30%蔗糖濃度,每個梯度加入蔗糖溶液體積分別為2,2,2,1,1mL。超離后吸出各條帶,加入 10倍無蔗糖緩沖液超離30 000r/min,30 min,4℃,去除樣品中的蔗糖。所得沉淀用無蔗糖緩沖液重懸,分裝后,一部分用Shimadzu UV-1800分光光度計測定其吸收光譜,其余凍存于–80℃待用。

1.5 Blue-native PAGE

BN-PAGE參照 Nijtmans[9]進行: 取凍存樣品,解凍后離心 8 000g,15 min,去上清。沉淀用增溶buffer(1.5 mol/L aminicaproic acid,50 mmol/L Bis-Tris/HCl pH=7.0)溶解后再加入 5% 十二烷基麥芽糖苷(dodecyl-β-maltoside,DM)或 1% Triton X-100進行增溶。去污劑/Chla(w/w)為5︰1,10︰1,15︰1,20︰1,冰浴30 min～1h后離心8 000g,10 min去除未溶解的沉淀。上清加入1︰10(v/v)上樣buffer(750 mmol/L aminocaproic acid,50 mmol/L Bis-Tris/HCl, pH 7.0(4℃),0.5 mmol/L EDTA,5% Coomassie-blue G250)后即可上樣。電泳緩沖液陰極 A: 50 mmol/L Tricine/15 mmol/L Bis-Tris/HCl,pH 7.0 (4℃)/0.02%(w/v)Coomassie-blue,陰極 B: 50mmol/L Tricine/15 mmol/L Bis-Tris/HCl,pH 7.0 (4℃);陽極: 50 mmol/L Bis-Tris/HCl,pH 7.0 (4℃)。電泳在 Bio-Rad 的Mini-Protean III cell 裝置中進行,分離膠為5%～13%梯度,濃縮膠為4%。凝膠大小為10 cm×8 cm×0.075cm。電泳在4℃進行,初始條件為50 V,30min,進入分離膠后為 120V,當(dāng)電泳前沿到達分離膠的一半時,用陰極緩沖液B代替陰極緩沖液A。當(dāng)藍(lán)色前沿到達凝膠底部時電泳結(jié)束。

1.6 SDS-Urea-PAGE第二向電泳

將第一向電泳凝膠用處理液(6 mmol/LUrea,5%SDS,10% 2-mercaptoethanol,50 mmol/LTris/HCl,pH 7.0,20% glycerin)室溫下平衡 1h,去離子水清洗 3次。將各復(fù)合物條帶分別切下,插入上樣孔后進行第二向電泳。電泳方法與常規(guī)SDS電泳基本相同。12%分離膠和5%濃縮膠中均含有6 mol/L尿素。電泳在Bio-Rad 的Protean II xi裝置中進行,凝膠大小為20 cm×20 cm×0.1cm。電泳后凝膠用考馬斯亮藍(lán) R250進行染色。

1.7 質(zhì)譜檢測

將第二向電泳凝膠上的點切下后,送至天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司進行質(zhì)譜檢測。具體步驟為將電泳染色后凝膠中的蛋白質(zhì)點切成1～2 mm2大小,清洗幾次后用含50%乙腈,25 mmol/L NH4HCO3(100 μL ,pH8.0)溶液浸泡膠塊,振蕩20 min后棄去溶液,重復(fù)3次至膠塊中藍(lán)色褪盡。蒸餾水洗滌1次。加入乙腈脫水,膠塊變白,然后室溫抽干。脫水膠塊加入胰蛋白酶溶液(10 mg/L Trypsin,50 mmol NH4HCO3,pH8.0)再水化,37℃保溫過夜。酶解膠塊加40 μL 5%TFA于40℃保溫1 h,吸出上清,加入40 μL 5% TFA,50% 乙腈于37℃保溫l h,小心吸出上清,抽真空干燥,4℃保存待用。用ABI 4700質(zhì)譜儀分析,數(shù)據(jù)在NCBI非冗余(nr)、Swissprot數(shù)據(jù)庫進行了檢索。

2 結(jié)果

2.1 類囊體膜的分離

樣品經(jīng)蔗糖密度梯度離心,分成 3條明顯的綠色條帶,分別位于40%,50%,60%蔗糖密度層(圖1)。位于離心管上端 30%蔗糖密度層的色素帶為游離色素和藻紅蛋白,其他較大的細(xì)胞碎片均沉于離心管底部。對所得 3條綠色條帶進行可見光吸收光譜測定,得到類囊體膜上蛋白的特征吸收峰(圖 2)。434～438 nm和680 nm左右為葉綠素a的特征吸收峰,488 nm左右和627 nm左右處為輔助色素吸收峰,其中488 nm為類胡蘿卜素,627 nm處可能是藻藍(lán)蛋白,418 nm為脫鎂葉綠素a吸收峰。所得3條類囊體膜條帶的吸收光譜基本一致。

圖1 蔗糖密度梯度離心分離類囊體膜Fig.1 Thylakoid membranes isolated by sucrose density gradients

圖2 40%、50%和 60%蔗糖密度層類囊體膜可見光吸收光譜Fig.2 Visible absorption spectra of thylakoid membranes located at 40%,50% and 60% sucrose layers

2.2 去污劑的選擇

實驗選用 40%蔗糖層分離到的類囊體膜進行去污劑的篩選。嘗試選用了兩種不同的去污劑 Triton X-100和DM對類囊體膜增溶,以比較藍(lán)綠溫和膠電泳分離的效果,結(jié)果顯示,確定DM/Chla(w/w)15︰1產(chǎn)生的效果較好,在BN-PAGE膠中可以分離到較多較清晰的條帶。相比較而言,用Triton X-100增溶類囊體膜時,只有少數(shù)膜蛋白復(fù)合物被分離,條帶較少,顯示增溶效果不充分(圖3,圖4)。

圖3 Triton X-100和DM增溶類囊體膜BN-PAGE電泳圖Fig.3 BN-PAGE analysis of thylakoid membranes solubilized by Triton X-100 and DM

圖4 不同濃度DM增溶類囊體膜BN-PAGE電泳Fig.4 BN-PAGE analysis of thylakoid membranes solubilized by different concentrations of DM

2.3 雙向電泳

選取蔗糖密度層 50%條帶制備得到的類囊體膜樣品進行第一向 BN-PAGE和第二向 SDS-Urea-PAGE電泳實驗。如圖5,第一向電泳得到4條清晰的條帶,既分離出4個蛋白復(fù)合物。為了進一步分析類囊體膜蛋白復(fù)合物的組成,將這 4條帶切下再做第二向電泳,在此條件下,復(fù)合物各蛋白質(zhì)亞基解離,依據(jù)各自分子質(zhì)量不同而分離。如圖 6,在第二向電泳中,各蛋白質(zhì)復(fù)合物的各個亞基可以被清晰地分開。為了確定各個亞基的性質(zhì),我們將第二向電泳膠上的15個蛋白點切取做質(zhì)譜鑒定。其中7個點有結(jié)果,其余8個點未與數(shù)據(jù)庫中蛋白序列比對上。質(zhì)譜結(jié)果 5: PSⅡ 47ku ,6: PSⅡ 44ku,7: cytochrome f ,8: PSⅡ D2, 9: PSⅡ D1,13: PSⅡ D2 ,14: PSⅡ D1 另外,1、2、3、4、10、11、12、15 號點未檢出。

圖5 BN-PAGE分離類囊體膜蛋白復(fù)合物Fig.5 BN-PAGE analysis of protein complexes in thylakoid menmbrane

圖6 雙向電泳分析類囊體膜蛋白組成Fig.6 Two-dimensional analysis of protein composition of thylakoid membrane

3 討論

以等電聚焦(isoelectric focusing,IEF)為第一向的雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE),是目前最常用來分離蛋白質(zhì)的技術(shù)。但一些分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)(大于200 ku),偏酸偏堿的蛋白質(zhì)以及疏水性較強的膜蛋白的分離,采用2D-PAGE往往不能得到理想的結(jié)果[10]。BN-PAGE改進了第一向電泳,使樣品保持復(fù)合物的活性在非變性條件下分離開。這一技術(shù)的難點首先在于去污劑的選擇與用量。去污劑太少復(fù)合物不容易從膜上分離出來,去污劑太強則會導(dǎo)致復(fù)合物的降解。本實驗采用了非離子型去污劑十二烷基麥芽糖苷 dodecylmaltosi- de(DM),這是一種溫和去污劑,能打斷脂質(zhì)間連接,而不破壞蛋白質(zhì)復(fù)合物的完整性。其次在電泳過程中以考馬斯亮藍(lán)G250代替SDS使蛋白質(zhì)復(fù)合物帶負(fù)電荷。因為 SDS作為離子載體同時也會是很強的去污劑,不僅會解離蛋白質(zhì)復(fù)合物,還會使蛋白徹底變性。考馬斯亮藍(lán)G250則不會使蛋白變性,而且在電泳的同時進行染色,含葉綠素的蛋白質(zhì)復(fù)合物如 PSⅠ,PSⅡ條帶呈綠色,不含葉綠素的蛋白質(zhì)復(fù)合物條帶呈藍(lán)色。另外第二向 SDS-PAGE中加入了尿素,提高了蛋白的溶解效率。然而最終分離到的蛋白點還是不多,原因可能與第二向電泳前的膠處理不充分有關(guān),這方面技術(shù)還有待改進。

陳熙等[11]研究水稻類囊體膜蛋白分離出 8個葉綠素蛋白復(fù)合物。Kantzilakis[12]研究單細(xì)胞綠藻Scenedesmus obliquus也分離出8個葉綠素蛋白復(fù)合物。Kügler[13]用BN-PAGE從菠菜的葉綠體中分離到6個葉綠素蛋白復(fù)合物。本實驗結(jié)果只有4個葉綠素蛋白復(fù)合物。高等植物的 PSⅡ捕光色素復(fù)合物是Lhc1至Lhc6其中由Lhcb1和Lhcb2組成的三聚體是PSⅡ主要的外周天線復(fù)合物[14]。而紅藻的主要捕光天線復(fù)合物是藻膽體,其附著在類囊體膜的外表面上,通過錨定蛋白與類囊體的光合膜相聯(lián)。本實驗中,制備類囊體膜樣品采用的研磨,超聲方法使得藻膽體從類囊體膜上脫落下來,并發(fā)生解離,因此電泳條帶結(jié)果不呈現(xiàn)捕光天線復(fù)合物的蛋白成分,與高等植物相比條帶較少。

此外,第二向電泳結(jié)果的質(zhì)譜分析,也只檢測到 PSⅡ有關(guān)的蛋白和細(xì)胞色素b6f連接蛋白等,而關(guān)于PSⅠ的蛋白均沒有檢測出來。原因是分離到的PSⅠ蛋白濃度較低,損失也較多,其蛋白量低于質(zhì)譜檢測要求,導(dǎo)致沒有成功檢出。

溫和膠電泳在研究葉綠體類囊體膜復(fù)合物的組成、生物發(fā)生中具有十分重要的作用,可使葉綠體蛋白質(zhì)復(fù)合物以近似天然的狀態(tài)分離。高等植物的葉綠體類囊體膜的研究已廣泛應(yīng)用這一技術(shù),并成功分離出多個蛋白復(fù)合物。對于條斑紫菜這種原始紅藻的類囊體膜研究,尚屬于起步階段,本實驗證實了溫和膠電泳與 SDS電泳結(jié)合在這方面應(yīng)用的可行性。

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