徐春明, 李　婷, 王英英, 龐高陽(yáng), 劉　穎

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心/北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

蕎麥(Fagopyrum esculentum Moench)為木蘭綱(magnoliopsida)蓼目(polygonales)蓼科(polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)雙子葉藥食兩用作物.蕎麥主要有兩個(gè)栽培種,分別為韃靼蕎麥(苦蕎)(Fagopyrum tataricum(Linn.)Gaertn.)和普通蕎麥(甜蕎)(Fagopyrum esculentum Moench).我國(guó)蕎麥分布較廣,華北、西北、東北地區(qū)多種植甜蕎,而西南地區(qū)的四川、云南、貴州等省則多種植苦蕎[1].苦蕎麥比小麥、稻米等谷物含有更豐富的黃酮、膳食纖維、維生素及礦物質(zhì)等對(duì)人體有益的物質(zhì)[2].苦蕎麥的籽粒、根莖葉及花都含有黃酮類(lèi)物質(zhì),這些黃酮類(lèi)物質(zhì)的主要成分為蘆丁,占總黃酮的70% ～80%[3].黃酮類(lèi)化合物在降血糖、抑菌抗炎癥、治療心血管疾病、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面都有明顯作用[4-5].從苦蕎麥中提取黃酮類(lèi)化合物的傳統(tǒng)提取方法有醇類(lèi)提取、熱水提取、堿提取、柱層析及其他溶液提取法.微波輔助提取法近年來(lái)廣泛應(yīng)用于天然活性成分的提取,可提高目標(biāo)物從固相轉(zhuǎn)移到液相的傳質(zhì)速率,從而提高提取產(chǎn)率[6];基于乙醇、異丙醇等有機(jī)物與無(wú)機(jī)鹽形成的新型雙水相體系與傳統(tǒng)的雙水相體系,即高分子聚合物/鹽體系相比,成本更低,萃取相不含黏度大、難處理的聚合物,且表現(xiàn)出良好的分離性能[7-8].本實(shí)驗(yàn)研究乙醇-硫酸銨雙水相提取苦蕎麥粉中黃酮類(lèi)化合物的提取條件(確定較優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)以及硫酸銨添加量);通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)初步優(yōu)化苦蕎麥粉中黃酮類(lèi)化合物的提取條件,并利用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化微波輔助雙水相提取苦蕎麥粉黃酮類(lèi)化合物的提取條件.

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

苦蕎麥粉,在北京永輝超市購(gòu)得苦蕎麥,用粉碎機(jī)粉碎并過(guò)40目篩制得;無(wú)水乙醇,分析醇,北京化工廠;硫酸銨,分析純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,色譜純,生工生物有限公司;氫氧化鈉,分析純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;亞硝酸鈉,分析純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;水合硝酸鋁,分析純,北京市匯海科儀科技有限公司.

1.2　儀器與設(shè)備

AL204型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;NC28105型微波萃取儀,Cemcorporation公司,SB25-120型超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;D-37520型離心機(jī),Sigma laborzentrifugen公司;TD5A型離心機(jī),湖南赫西儀器裝備有限公司;SpectraMAX190型酶標(biāo)儀,Molecular Devices;FW400A型萬(wàn)能粉碎機(jī),北京中興偉業(yè)有限公司;HH-4型水浴鍋,華港通國(guó)際有限公司;Eppendorf 96孔板,Eppendorf中國(guó)有限公司.

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1提取黃酮類(lèi)化合物

參考文獻(xiàn)[9],提取苦蕎麥粉中黃酮類(lèi)化合物.將過(guò)40目篩的苦蕎麥粉,放入烘箱中,溫度恒定為60℃,烘干,待物料恒重后取出,密封袋包裝好,稱(chēng)重,備用.準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g苦蕎麥粉于200 mL溶劑中,首先靜置約10 min,目的是為了讓苦蕎麥粉在微波前更好的浸透于溶劑中,從而提高微波提取效率.后進(jìn)行微波輔助提取,提取結(jié)束后進(jìn)行離心5 000 r/min,15 min,后取上清液,加入硫酸銨,靜置,分相.上層液體為乙醇相.將兩相分離,將上層液體進(jìn)行離心,5 000 r/min,5 min,取上清液,妥善保存,待測(cè).最后測(cè)上清液黃酮含量,取上清液2 mL于10 mL容量瓶,定容,搖勻,用96孔板測(cè)其吸光度,并對(duì)照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮類(lèi)化合物含量及其提取率,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.2總黃酮含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.10 g蘆丁,置500 mL燒杯中,加入乙醇溶解,后轉(zhuǎn)移置500 mL容量瓶中,定容,制得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液.用移液管準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL分別置于10 mL容量瓶中,分別加乙醇溶液至3.0 mL,加ω(NaNO2)為5%的水溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min,加 ω(Al(NO)3)為10%的水溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min,最后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL,再加入φ(乙醇)30%的溶液定容至刻度線,搖勻,放置15 min,在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.以吸光度為縱坐標(biāo);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),mg/L,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)圖1.

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of rutin

計(jì)算回歸方程為y=0.004 2x-0.002 9(R2=0.998 7),確定了0～60 mg/L蘆丁吸光度與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系.

1.3.3雙水相體系的確定及單因素實(shí)驗(yàn)

確定苦蕎麥粉中黃酮類(lèi)化合物提取的較優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)以及硫酸銨添加量.以微波提取時(shí)間、微波提取功率、料液比為因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察各個(gè)因素分別對(duì)苦蕎麥粉黃酮得率的影響.

1.3.4Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,確定自變量,以苦蕎麥粉總黃酮得率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面分析法安排實(shí)驗(yàn)以獲取較佳提取條件,并用Design-Expert 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

2　結(jié)果與討論

2.1　苦蕎麥粉黃酮類(lèi)化合物提取的較優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)以及硫酸銨添加量

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)研究表明乙醇-硫酸銨雙水相在乙醇體積分?jǐn)?shù)為18%～55%范圍內(nèi),添加適量硫酸銨時(shí)乙醇-硫酸銨可以分成兩相.本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行乙醇-硫酸銨較優(yōu)配比的探究.在分成兩相的乙醇體積分?jǐn)?shù)區(qū)間取整數(shù)體積比以方便實(shí)驗(yàn)研究,因此乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍為20%～50%,取體積分?jǐn)?shù)20%,30%,40%,50%,硫酸銨以0.1 g/mL作為最小單位分組,共分為6組,0.2～0.7 g/mL.根據(jù)上述條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),所得雙水相上層液體體積與乙醇的體積分?jǐn)?shù)和硫酸銨添加量關(guān)系如表1.

表1　乙醇體積分?jǐn)?shù)和硫酸銨添加量對(duì)雙水相上層液體體積的影響Tab.1　Effect of ammonium sulfate dosage and alcohol concen-tration on top phase volume of aqueous two-phase___

從表1可得,乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí),硫酸銨添加量為0.3～0.5 g/mL時(shí),上層液體體積近似于溶液中的乙醇體積,列入以下實(shí)驗(yàn)考慮中,而硫酸銨的添加量需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定.乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%和50%時(shí),恰恰與20%乙醇雙水相呈現(xiàn)相反現(xiàn)象,綜合考察雙水相系線原則、萃取時(shí)操作方便、萃取率等因素[10],確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí),萃取效果較佳,且理想硫酸銨添加量考慮范圍為0.3～0.5 g/mL.

2.1.2最佳硫酸銨濃度的確定

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,乙醇體積分?jǐn)?shù)選定為30%,硫酸銨添加范圍為0.3～0.5 g/mL,以0.02 g/mL作為最小單位,進(jìn)行細(xì)化實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖2.

圖2　硫酸銨添加量對(duì)30%乙醇上層液體體積的影響Fig.2　Effect of ammonium sulfate dosage on top phase volume of aqueous two-phase including 30%ethanol

從圖2可得,當(dāng)硫酸銨添加量在0.38～0.39 g/mL與添加量在0.42～0.44 g/mL時(shí)最接近雙水相中真實(shí)乙醇含量.

2.2　苦蕎麥粉中黃酮類(lèi)化合物提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1微波提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

在其他因素相同的條件下,改變微波提取時(shí)間,考察其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響.雙水相體系溶劑為φ(乙醇)30%,苦蕎麥粉在提取溶劑中的質(zhì)量濃度0.025 g/mL,微波功率500 W,微波時(shí)間為30～150 s(以30 s為一個(gè)單位),最高溫度65℃(溫度過(guò)高時(shí),儀器自動(dòng)降低微波功率,使之不超過(guò)設(shè)置值)的條件下,進(jìn)行微波輔助提取操作,后添加0.38 g/mL硫酸銨溶液進(jìn)行分相,最后計(jì)算苦蕎麥粉的黃酮得率,如圖3.

圖3　微波時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.3　Effect of microwave time on extraction yield of total flavonoids

從圖3可知,苦蕎麥麥粉微波時(shí)間在50～70 s有一個(gè)峰值,并且峰值靠近60 s數(shù)據(jù)點(diǎn),而對(duì)于K值最大點(diǎn),考慮最大得率和最經(jīng)濟(jì)兩種情況兼顧,故在以下細(xì)化實(shí)驗(yàn)中,微波時(shí)間的考慮范圍均為40～80 s.

2.2.2微波功率對(duì)黃酮提取率的影響

雙水相體系,溶劑為30%乙醇,苦蕎麥粉在提取溶劑中的質(zhì)量濃度0.025 g/mL,微波功率分別為,300～700 W(每100 W為一個(gè)單位)微波提取時(shí)間80 s,最高溫度65℃的條件下,進(jìn)行微波輔助萃取操作,然后添加硫酸銨進(jìn)行分相,最后用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度,計(jì)算黃酮得率,數(shù)據(jù)如圖4.

圖4　微波功率對(duì)黃酮得率的影響Fig.4　Effect of microwave power on the extraction yield of total flavonoids

由圖4可知,微波功率對(duì)于苦蕎麥麥粉的影響較大,微波功率在500～600 W有一個(gè)峰值,并且峰值靠近500 W數(shù)據(jù)點(diǎn),而且經(jīng)過(guò)500 W這個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)后,苦蕎麥黃酮的得率有明顯下降,微波功率從400～500 W,總黃酮得率有明顯的升高,在進(jìn)一步的細(xì)化實(shí)驗(yàn)中,微波功率選擇從450～550 W.

2.2.3料液比對(duì)黃酮提取率的影響

雙水相體系,溶劑為30%乙醇,料液比(苦蕎麥粉的質(zhì)量與作為浸提液溶劑的體積比,g/mL)從1∶30到1∶70,微波功率為 500 W,微波時(shí)間 60 s,最高溫度65℃的條件下進(jìn)行微波輔助提取,后添加硫酸銨進(jìn)行分相,最后用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度并計(jì)算黃酮得率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5.

從圖5可以看出針對(duì)苦蕎麥粉中提取苦蕎麥黃酮得率最高點(diǎn)位于料液比1∶60(g/mL)數(shù)據(jù)點(diǎn)左右,當(dāng)料液比超過(guò)1∶50(g/mL)后,苦蕎麥黃酮的得率變化不大,而當(dāng)料液比高于1∶70(g/mL)時(shí),提取就會(huì)變得相對(duì)不經(jīng)濟(jì).針對(duì)這種情況,考察酶標(biāo)儀測(cè)得的苦蕎麥粉提取黃酮類(lèi)化合物吸光度與料液比之間的關(guān)系,并作圖6.

圖5　料液比對(duì)黃酮得率的影響Fig.5　Effect of material-to-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

圖6 料液比對(duì)吸光度的影響Fig.6　Effect of material-to-liquid ratio on absorbance

圖6表明,當(dāng)料液比從 1∶30 ～1∶50(g/mL)時(shí),溶劑利用度較高,而考慮到當(dāng)料液比為1∶50～1∶60(g/mL)時(shí)得率最高,為避免資源浪費(fèi),在后續(xù)細(xì)化實(shí)驗(yàn)中料液比擬定為1∶30～1∶50(g/mL).

2.3　苦蕎麥粉黃酮提取的響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田志芳一個(gè)人在地窩子里，看看頭頂，看看腳下，一屁股坐在土臺(tái)上，嘆口氣，心想姆媽拼死阻攔都沒(méi)攔住她和哥哥，現(xiàn)在怪誰(shuí)呢，自己跳起腳要支邊。她垂下頭，把手中的沙棗花捧起來(lái)瞧，帶沙點(diǎn)的葉根處，確實(shí)有細(xì)小的花苞，同樣泛出密密麻麻的沙塵，形如青色的米粒，一粒一粒擠在一起，好似家鄉(xiāng)中秋的桂花。猜想，沙棗花開(kāi)了，是不是真有桂花那樣的千里香？

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選擇微波功率(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析,確定苦蕎麥粉黃酮提取的較優(yōu)條件,試驗(yàn)因素水平組合見(jiàn)表2,Box-Behnken設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表3和表4.

表2　響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Tab.2　Factors and levels of response surface analysis

表3　Box-Behnken設(shè)計(jì)和結(jié)果Tab.3　Box-Behnken design and results

采用Design-Expert 7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得到苦蕎麥粉黃酮提取率對(duì)A微波功率(W)、B提取時(shí)間(s)、C料液比(g/mL)的二次多項(xiàng)回歸方程為:

表4　回歸模型的方差分析Tab.4　Variance analysis for established regression model

如表4,通過(guò)方差分析,回歸模型極顯著分析,除了AB和BC交互項(xiàng)之外,其他各項(xiàng)對(duì)結(jié)果的影響均達(dá)到顯著水平,失擬值不顯著,模型的 R2=0.969 3說(shuō)明模型與實(shí)際的試驗(yàn)結(jié)果的擬合程度較好,可以用此模型對(duì)苦蕎麥粉中的黃酮提取率進(jìn)行預(yù)測(cè).

2.3.2響應(yīng)面分析

對(duì)微波功率、提取時(shí)間、料液比三因素交互作用,做響應(yīng)曲面圖,見(jiàn)圖7.

圖7　各因素交互作用對(duì)總黃酮得率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.7　Response surface plots and contour plots showing effects of pairwise interactions of factors on extraction yield of total flavonoids

從圖7中可以看出,微波提取時(shí)間與料液比相互作用對(duì)苦蕎麥粉黃酮提取率的影響不明顯,等勢(shì)面接近于圓形,微波提取時(shí)間與微波功率相互作用對(duì)苦蕎麥粉黃酮提取率的影響也不明顯,等勢(shì)面亦接近于圓形,而料液比與微波功率相互作用對(duì)苦蕎麥粉黃酮提取率的影響十分明顯,等勢(shì)面是明顯的橢圓形.根據(jù)回歸方程及上述分析,響應(yīng)面存在最大值,解方程可得苦蕎麥粉中黃酮的較優(yōu)提取條件為微波功率534.73 W,處理時(shí)間為71.34 s,料液比為1∶48.79(g/mL),理論最大萃取得率為14.18 mg/g.考慮實(shí)際操作,取微波功率550 W,處理時(shí)間為70 s,料液比為1∶50(g/mL),三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值為13.82 mg/g,基本與預(yù)測(cè)值相近.由此可見(jiàn),該模型能夠較為準(zhǔn)確地反映出三種因素對(duì)于苦蕎麥粉中的黃酮提取率的影響.

3　結(jié) 論

利用乙醇-硫酸銨雙水相微波輔助提取苦蕎麥粉中黃酮類(lèi)化合物的較優(yōu)條件為萃取劑是體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液,微波功率550 W,微波提取時(shí)間70 s,料液比為1∶50(g/mL),苦蕎麥粉中黃酮類(lèi)化合物提取率為13.82 mg/g.而苦蕎麥粉中苦蕎麥黃酮含量約占總重量的2.31%[11],利用乙醇-硫酸銨雙水相微波輔助提取苦蕎麥粉中黃酮的得率約為1.38%,占總黃酮量的59.7%,得率較高,操作不復(fù)雜,用時(shí)較短,具有較強(qiáng)的可操作性.由此可得乙醇-硫酸銨雙水相微波輔助提取適合于苦蕎麥粉中黃酮類(lèi)化合物的提取.