宗萬里, 魯　剛

(威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,山東威海 264209)

孔雀石綠(malachite green,MG)又稱苯胺綠、堿性綠、維多利亞綠或中國綠,是一種具有三苯甲烷結(jié)構(gòu)的化工染料.因其對養(yǎng)殖魚類的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病的獨(dú)特作用,在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)曾廣泛應(yīng)用.但孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠具有高毒性、高殘留、高致癌和高致畸、致突變等副作用.我國農(nóng)業(yè)部于2002年5月將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中,禁止用于所有食品動物.同時(shí)還頒布的《無公害食品標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》(NY 5070—2002)明確指出孔雀石綠不得檢出.但由于孔雀石綠對魚類水霉病、小瓜病等寄生蟲性魚病獨(dú)特的防治效果,低廉的價(jià)格,況且現(xiàn)在仍無優(yōu)良的替代藥物,為此養(yǎng)殖戶仍然在偷偷使用[1].目前測定魚肉中孔雀石綠及其代謝物的檢測方法主要為ELISA檢測方法[2]、高效液相色譜法[3-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-12].本文利用加標(biāo)空白樣品提取液制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線來校正樣品的基質(zhì)效應(yīng)以及回收率,使用甲醇直接提取鮮魚肉中殘留的孔雀石綠及其代謝物后直接上機(jī)檢測,研究建立了一種較為快速的測定鮮魚肉中的孔雀石綠及其代謝物殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,并取得較好效果.

1　材料與方法

1.1　試劑與儀器

甲醇,色譜純,TEDIA公司;甲酸,分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液,100 μg/mL,農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所研制;隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品,Dr Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈,色譜純,德國默克公司;實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水;50 mL刻度離心管.

UltiMate 3000型高效液相色譜儀,Thermo fisher公司;Thermo fisher TSQQUANTUM型三重四極桿質(zhì)譜檢測器(配電噴霧離子源ESI),Thermo fisher公司;Hypersil Gold型反相液相色譜柱(2.1 mm×100 mm,3μm),Thermo fisher公司;0.22μm有機(jī)相針管濾膜,Agela公司;樣品粉碎機(jī),九陽股份有限公司.

1.2　液相色譜條件

流動相為乙腈和體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸的水溶液,梯度洗脫為0～0.5 min,乙腈保持10%;0.5～6.5 min,乙腈由10%升至90%;6.5～9 min,乙腈保持90%;9～9.5 min,乙腈由90%降至10%;9.5～13 min,乙腈保持 10%;流速 0.2 mL/min,柱溫25℃;進(jìn)樣量10μL.

1.3　質(zhì)譜條件

電噴霧離子源,正離子模式;噴霧電壓3 500 V;離子源溫度為室溫;鞘氣壓力為35 psi(2.07×105Pa);輔助氣壓力為10 ATM(1.01×106Pa);離子傳輸毛細(xì)管溫度為350℃;碰撞氣體為氬氣,1.5 m torr(0.20 Pa);質(zhì)譜divert valve狀態(tài)為0～8 min處于waste狀態(tài),8～10 min處于load狀態(tài),10～13 min處于waste狀態(tài);選擇反應(yīng)掃描(selective reaction monitoring,SRM)模式檢測,定量離子及定性離子利用儀器優(yōu)化選出.碰撞能量采用儀器優(yōu)化出的數(shù)值,質(zhì)譜分析離子碎片以及優(yōu)化后的碰撞能量見表1.

表1　孔雀石綠及隱色孔雀石綠的離子碎片及碰撞能量Tab.1　Product ions and collision energy of malachite green and leucomalachite green

1.4　溶液配制

體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸的水溶液制備方法是吸取0.5 mL甲酸加入到500 mL水中,經(jīng)0.22μm水相濾膜過濾.

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確吸取0.5 mL的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液至50 mL容量瓶中,用甲醇定容,得1μg/mL的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液.準(zhǔn)確稱取50 mg的隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液至50 mL容量瓶中,用甲醇定容,得1 000μg/mL的隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液.準(zhǔn)確吸取0.1 mL的隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液至100 mL容量瓶中,用甲醇定容,得1μg/mL的隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液.各從1 μg/mL的孔雀石綠及隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別吸取0.025,0.05,0.1,0.2,0.25 mL加入到5個(gè)各加入5 g空白魚肉樣品的50 mL帶有刻度的離心管中,用甲醇溶液定容至25 mL,充分振蕩,得1,2,4,8,10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液.每個(gè)濃度溶液經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾后,取10μL注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析.

1.4.3樣品前處理

我不再說話，走出宿舍區(qū)附近的一片烏桕樹林。心情像是發(fā)黃的火紙，又像是深秋煙雨中飄落的梧桐樹葉子。本來沒有雨，我感覺天在下雨，雨水涼涼的，像天上落下的泥鰍，一條又一條鉆入我的衣領(lǐng)?？諝獾念伾珳啙岬南褚粔u油，整個(gè)世界都涂滿醬油一樣的褐色?？諝饫镉幸还蔂€淤泥的味道，和汽車尾氣夾雜在一起，繭一般地把我裹起來，我像一只落魄的小鳥，在饑餓里翻飛。

準(zhǔn)確稱取經(jīng)樣品料理機(jī)粉碎的待測鮮魚肉樣品5 g,加入至50 mL刻度離心管中,在樣品中加入甲醇定容至25 mL,充分振蕩,靜置后取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾后,取10μL注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,進(jìn)行分析.

2　結(jié)果與討論

2.1　樣品前處理

在眾多的檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠及隱色孔雀石綠的方法中,樣品處理液的制備過程通常是采用一系列凈化操作過程,操作較為煩瑣并且浪費(fèi)時(shí)間,且在固相萃取時(shí)如果操作不慎會使回收率下降且使分析結(jié)果重復(fù)性變差,由于孔雀石綠及其代謝物易溶于甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑,且蛋白、脂肪這些樣品中主要成分不易溶于甲醇、乙腈,但是乙腈提取液在靜置后較為渾濁,需要凈化.本文采用甲醇直接浸泡提取鮮魚肉中孔雀石綠及隱色孔雀石綠,樣品處理液用0.22μm的有機(jī)濾膜過濾后,就注入高效液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀中進(jìn)行檢測.考慮到在電噴霧質(zhì)譜分析中,復(fù)雜基質(zhì)的樣品可能會產(chǎn)生與分析物競爭電荷降低離子化效率的基質(zhì)效應(yīng),本文通過使用空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,以消除樣品的基質(zhì)效應(yīng)以及校正回收率,經(jīng)過試驗(yàn)證明,方法準(zhǔn)確度較高.

2.2　色譜圖

實(shí)驗(yàn)得到孔雀石綠及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)樣品、空白樣品、加標(biāo)空白樣品的總離子流(total ion chromatogram,TIC)圖分別如圖1、圖2和圖3.加標(biāo)后鮮魚肉樣品不經(jīng)過色譜柱分離,而直接在m/z 311～315 u進(jìn)行全掃描質(zhì)譜分析見圖4.孔雀石綠及其代謝物的出峰時(shí)間在8～10 min.在該色譜質(zhì)譜條件下,實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好.

2.3　標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

圖1　孔雀石綠及隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)樣品的TICFig.1　TIC chromatograms of standards of malachite green and leucomalachite green

圖2　空白鮮魚肉樣品的TICFig.2　TIC chromatogram of blank fresh fish meat

圖3　加標(biāo)鮮魚肉樣品的TICFig.3　TIC chromatogram of blank fresh fish meat added with malachite green and leucomalachite green

在實(shí)驗(yàn)條件下,以峰面積y為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度x(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性方程,以基線噪聲3倍峰面積對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限(limit of detection,LOD)(S/N=3),以基線噪聲10倍峰面積對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限(limit of quantity,LOQ)(S/N=10)[13],回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2.

圖4　311～351 u加標(biāo)鮮魚肉樣品全掃描質(zhì)譜Fig.4　Mass spectrum of sample dilution with standard in SCAN mode during 311～351 u

表2　回歸曲線的基本參數(shù)Tab.2　Basic parameters of the regression equation

2.4　精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取不含孔雀石綠及其代謝物的鮮魚肉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),向5 g樣品中分別添加1μg/mL孔雀石綠及隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液0.025,0.125,0.25 mL,即樣品中孔雀石綠及隱色孔雀石綠含量為分別為5,25,50μg/kg.按1.4.3節(jié)樣品處理方法進(jìn)行樣品處理,重復(fù)6次,精密度和回收率計(jì)算結(jié)果見表3.

表3　樣品添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)Tab.3　Spiked recovery and precision test

由表3可知,采用本方法所得數(shù)據(jù)滿足檢測要求.

3　結(jié) 論

通過實(shí)驗(yàn)建立了甲醇直接浸泡提取法測定鮮魚肉中孔雀石綠及其代謝物含量的高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法,前處理簡單,無須固相萃取等一系列凈化、濃縮過程.測試結(jié)果穩(wěn)定且準(zhǔn)確度較高,樣品加標(biāo)回收率符合標(biāo)準(zhǔn)檢測方法要求范圍,在靈敏度與精確度方面能與已報(bào)道的相關(guān)檢測方法到達(dá)一致水平.該方法節(jié)省了檢測時(shí)間,又節(jié)約檢測成本,在實(shí)際的檢測工作中具有一定的參考價(jià)值.該方法的靈敏度高,選擇性好,不需要特殊的凈化,縮短了整個(gè)樣品的分析時(shí)間,適用于鮮魚肉中的孔雀石綠及其代謝物的快速定性及定量分析.

參考文獻(xiàn)：