許俊潔， 陳 鍵， 鄭凱玲， 魯國(guó)東(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 福建 福州 350002)

1 引言

己糖載體蛋白的功能在許多生物中已經(jīng)有報(bào)道，其中，哺乳類動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了13種己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Rogersetal., 2003)。在人體內(nèi)，葡萄糖能調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、酶活，激素分泌和受葡萄糖調(diào)節(jié)的神經(jīng)細(xì)胞的活性(Thorens1etal., 2012；Wetal., 1993)。糖感應(yīng)途徑和糖信號(hào)途徑如果不能正常調(diào)控，則會(huì)引發(fā)代謝的嚴(yán)重?zé)o序(Kimetal., 2013)。但是，細(xì)胞是如何感受并轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的，目前這種機(jī)制尚不清楚(Karhumaaetal., 2010)。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的己糖載體蛋白研究較為深入，已鑒定出20個(gè)己糖載體蛋白(Kimetal., 2013；Dietzeletal., 2012；Leandroetal., 2009)。Reifenberger 等通過(guò)構(gòu)建釀酒酵母hxt1-7缺陷突變體，發(fā)現(xiàn)此突變菌株在葡萄糖、果糖、甘露醇和蔗糖培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，而將基因Hxt1,Hxt2,Hxt3,Hxt4,Hxt6,Hxt7和Gal2分別互補(bǔ)hxt1-7缺失突變菌株均能在含有葡萄糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(Maieretal., 2002)。研究表明，釀酒酵母中葡萄糖的傳感、吸收調(diào)節(jié)及葡萄糖利用率之間有著復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(Liuetal., 2013 )。此外，在Neurosporacrassa,Aspergillusnidulans和Colletrotrichumgraminicola中也都鑒定出數(shù)個(gè)己糖載體蛋白基因(Madietal.,1997；Lingneretal., 2011；Reisetal., 2013；Lietal., 2014 )。

稻瘟病是世界性重大病害(Klausetal., 2012)，研究稻瘟病菌的致病機(jī)理有著重要意義。目前，稻瘟病菌和水稻互作過(guò)程中糖代謝調(diào)控途徑的研究還很少有報(bào)道，尤其是稻瘟病菌攝取糖類的途徑和機(jī)理目前幾乎還是空白(Ebbole，2007)。最近，Hiromasa Saitoh 等首次發(fā)現(xiàn)了稻瘟病菌的一個(gè)己糖載體蛋白基因MOST1( Saitohetal., 2014)。另有報(bào)道稱，稻瘟病菌侵染水稻被證明是依賴于稻瘟病菌的6-P葡萄糖的傳感器Tps1，它能融合碳源和氮源代謝，并對(duì)可利用的葡萄糖做出反應(yīng)(Reisetal., 2013)。本文將通過(guò)生物信息學(xué)的方法，對(duì)稻瘟病菌中的己糖載體蛋白家族進(jìn)行初步分析，為進(jìn)一步研究它們的功能奠定基礎(chǔ)。

2 方法

2.1 序列選擇和序列比對(duì)

為查找稻瘟病菌中可能存在的己糖載體蛋白，利用該載體蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Sugar_tr的氨基酸序列搜索稻瘟病菌數(shù)據(jù)(http:∥www.broadinstitute.org/annotation/genome/magnaporthe_comparative/MultiHome.html)。同時(shí)，選擇釀酒酵母、構(gòu)巢曲霉和粗糙脈胞酶已經(jīng)鑒定功能的部分己糖載體蛋白，并與稻瘟病菌中預(yù)測(cè)的己糖載體蛋白進(jìn)行比對(duì)分析。相關(guān)蛋白序列搜索數(shù)據(jù)庫(kù)：構(gòu)巢曲霉(http:∥www.broadinstitute.org/annotation/genome/aspergillus group/MultiHome.html)粗糙脈胞酶(http:∥www.broadinstitute.org/annotation/genome/neurospora/MultiHome.html)釀酒酵母(http:∥www.broadinstitute.org/annotation/genome/saccharomyces_cerevisiae)。炭疽病菌數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.broadinstitute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/MultiHome.html)。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

根據(jù)氨基酸序列，使用DNAMAN軟件中的Multiple Alignment分析得到Phylogenetic_Tree。

2.3 跨膜螺旋結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域分析

分別用結(jié)構(gòu)域分析在線軟件(http:∥string-db.org/newstring_cgi/show_input_page.plUserId =eNQqcNmAi0rN&sessionId=18b__pDB_cxA)和跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)預(yù)測(cè)蛋白進(jìn)行單獨(dú)分析。

2.4 基因表達(dá)量分析

稻瘟病菌的附著胞形成階段的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)主要來(lái)源于(http:∥cogeme.ex.ac.uk/supersage/)。侵染階段基因表達(dá)量來(lái)自于實(shí)驗(yàn)室之前所做的基因芯片雜交試驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 稻瘟病菌己糖載體蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立

通過(guò)Blast搜索比對(duì)，在稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)sugar_sr家族有67個(gè)同源蛋白，推測(cè)其為己糖載體蛋白。選擇釀酒酵母的糖信號(hào)受體蛋白R(shí)gt2、Snf3；構(gòu)巢曲霉和粗糙脈胞酶中分別已經(jīng)鑒定為葡萄糖載體的部分蛋白NCU_02582、NCU_04963、NCU_06133、NCU_06138、NCU_10021、hxtC(ANID_10891)、hxtD(ANID_08737)、hxtE (ANID_01797)、ANID_06923 ；炭疽病菌中鑒定出的己糖載體蛋白 CgHXT1、CgHXT2、CgHXT3、CgHXT4、CgHXT5與稻瘟病菌中這67個(gè)蛋白一起，共同建立了進(jìn)化樹(shù)(圖1)。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析可以看出，稻瘟病菌己糖載體蛋白與N.crassa、A.nidulans和C.graminicola中已鑒定出的部分己糖載體蛋白有一定的同源性(從42%到74%)。MGG_06203分別與N.crassa的NCU_04963和A.nidulans的葡萄糖載體蛋白hxtC(ANID_10891)、hxtE (ANID_01797)以及C.graminicola的己糖載體蛋白CgHXT1同源最高，其中與CgHXT1同源性可達(dá)72%。MoST1與NCU_02582和CgHXT4同源。MGG_15700(MGG_01446.6)分別與NCU_10021、CgHXT3和hxtD(ANID_08737)同源。MGG_00040與CgHXT2高度同源，而與A.nidulans、C.graminicola個(gè)別蛋白有較低的同源性。MGG_13651只與葡萄糖載體蛋白ANID_06923有43%的同源性。MGG_05946與NCU_06138同源性最高達(dá)74%。稻瘟病菌中沒(méi)有與釀酒酵母中的葡萄糖信號(hào)受體Rgt2和Snf3高度同源的蛋白，但是有幾個(gè)蛋白與其有一定的同源性(39%)。

圖1稻瘟病菌中67個(gè)己糖載體蛋白與釀酒酵母、N.crassa、A.nidulans
和C.graminicola中已知功能的部分己糖載體蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系
Figure 1 The phylogenetic relationship of 67 hexose transporter inM.oryzaeand some identified hexose transporters inS.cerevisiae,N.crassa,A.nidulansandC.graminicola

3.2 稻瘟病菌己糖載體蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的分析

通過(guò)在線軟件TMHMM Server v. 2.0對(duì)預(yù)測(cè)的67個(gè)蛋白進(jìn)行跨膜分析，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)上存在一定的差異。根據(jù)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)螺旋分為6類，其中MGG_03620等26個(gè)蛋白具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)螺旋，圖2所示的為MGG_00040的12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，前100個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成2個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)，100到200的氨基酸位點(diǎn)之間有4個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)，氨基酸位點(diǎn)從200到300之間無(wú)螺旋結(jié)構(gòu)，而剩下的約200個(gè)氨基酸位點(diǎn)構(gòu)成了6個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，這些峰值的準(zhǔn)確性約為90%以上。MGG_02783 等12個(gè)蛋白具有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)螺旋；MGG_00346等22個(gè)蛋白具有10個(gè)的跨膜結(jié)構(gòu)螺旋；4個(gè)蛋白有9個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)螺旋； MGG_07546只有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)螺旋；而最為特殊的是MGG_07844有16個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)螺旋結(jié)構(gòu)。不具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白，不代表其預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)不足12個(gè)，而是有些跨膜螺旋的峰值的可能性低于80%；當(dāng)然，也有部分蛋白預(yù)測(cè)的跨膜螺旋沒(méi)有12個(gè)。根據(jù)Maria Jos′e Leandro等預(yù)測(cè)分析，酵母中的己糖載體蛋白的12層跨膜結(jié)構(gòu)模型見(jiàn)圖3。它們的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)鑲嵌在膜上， 蛋白質(zhì)的C端和N端都伸入到細(xì)胞內(nèi)部。

圖2 稻瘟病菌基因MGG_00040的12個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)圖Figure 2 The twelve transmembrane domains of gene MGG_00040 in M.oryzae

圖中的5個(gè)位點(diǎn)(A-E)分別代表在糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中已經(jīng)鑒定出的基序 圖3 釀酒酵母已糖載體跨膜結(jié)構(gòu)模型Figure 3 Transmembrane model of S.cerevisiae

由結(jié)構(gòu)域在線分析軟件STRING 9.1分析預(yù)測(cè)稻瘟病菌67個(gè)蛋白。其中有66個(gè)的蛋白由于氨基酸序列的重疊都有兩種形式的結(jié)構(gòu)域：Sugar_tr和MFS_1，如圖4所示，這類蛋白所具有的此類結(jié)構(gòu)域的數(shù)目以及形成的結(jié)構(gòu)域氨基酸位點(diǎn)不同。而MGG_15700蛋白只有一種Sugar_tr式的結(jié)構(gòu)域。另外，較為特殊的是MGG_09307和MGG_13930蛋白各有一個(gè)TRI12結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域存在于有些致病真菌中，與單端孢毒素的生物合成有關(guān)。同時(shí)，MGG_13651含有一個(gè)DUF791結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域存在于真核生物中，但是具體的功能目前未知。

圖4基因MGG_03620的兩種不同形式的結(jié)構(gòu)域
Figure 4 Two different forms of domains in geneMGG_03620

3.3 稻瘟病菌己糖載體蛋白基因的表達(dá)分析

3.3.1 稻瘟病菌附著胞形成過(guò)程中己糖載體蛋白基因的表達(dá)分析 預(yù)測(cè)的67個(gè)蛋白中，可以從數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到稻瘟病菌菌株Guy11對(duì)應(yīng)的63個(gè)蛋白在附著胞形成過(guò)程中的表達(dá)量數(shù)據(jù)。根據(jù)Xu等研究，稻瘟病菌分生孢子著落在寄主植物表面，30min內(nèi)會(huì)萌發(fā)形成芽管，8h后大部分細(xì)胞會(huì)分化形成附著胞，24 h后，90%以上的分生孢子會(huì)形成帶有芽管的成熟分化的附著胞，之后產(chǎn)生侵染釘侵入植物細(xì)胞(Xuetal., 1996)。因此，附著胞的形成對(duì)于稻瘟病菌是否能成功侵染寄主細(xì)胞起著關(guān)鍵作用。文章中選出表達(dá)量變化差異性較大同時(shí)又具有代表性的14個(gè)基因進(jìn)行分析。其中，MGG_15700的表達(dá)量極高，在基本培養(yǎng)基MM上生長(zhǎng)，其表達(dá)量達(dá)到5033.34。相反，基因MGG_09307的表達(dá)量為0，而在CM培養(yǎng)基上也只有1.965。基因MGG_00040和MGG_03360的表達(dá)量在附著胞形成過(guò)程中不斷升高，分別從9.61和74.61升高到72.24和186.37?；騇GG_03620、MGG_06203從4 h到6 h表達(dá)量有升高，而后，表達(dá)量持續(xù)下降。而其他基因表達(dá)量不規(guī)律，尤其在6 h、8 h和14 h之間波動(dòng)較大(表1)。

表 1 稻瘟病菌己糖載體蛋白基因在附著胞形成過(guò)程中不同時(shí)段的表達(dá)量Table 1 The hexose transporter genes expression in M.oryzae during appresorium develpment

3.3.2 稻瘟病菌侵染水稻48h后的己糖載體蛋白基因的表達(dá)分析 預(yù)測(cè)的67個(gè)己糖載體蛋白中，有25個(gè)蛋白基因在稻瘟病菌侵染水稻48h后有明顯上調(diào)表達(dá)。其中，基因MGG_09607, MGG_09680, MGG_09852, MGG_10530上調(diào)最為明顯，表達(dá)量倍數(shù)超過(guò)6；基因MGG_07884, MGG_09307, MGG_10816有上調(diào)，但表達(dá)量倍數(shù)未超過(guò)3；其他17個(gè)基因表達(dá)量倍數(shù)處于3倍到6倍之間(圖5)。

圖5 稻瘟病菌己糖載體蛋白基因在侵染階段的表達(dá)量Figure 5 The hexose transporter genes expression in M.oryzae during infection process

4 討論

本研究通過(guò)同源性比對(duì)預(yù)測(cè)稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫(kù)中有67個(gè)己糖載體蛋白，這與Saitoh等的研究一致(Saitohetal., 2014)。稻瘟病菌中，MGG_06203分別與NCU_04963、hxtC(ANID_10891)、hxtE (ANID_01797)、 CgHXT1同源，且與CgHXT1同源性高達(dá)72%。MGG_00040與CgHXT2高度同源，而與A. nidulans、C.graminicola的相應(yīng)己糖載體蛋白有較低的同源性。此外，稻瘟病菌中有的蛋白與釀酒酵母的己糖信號(hào)受體有一定的同源性。由此推測(cè)，己糖載體蛋白在不同生物中存在特定堿基的保守性。

對(duì)67個(gè)己糖載體蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其跨膜螺旋數(shù)目分為8、9、10、11、12、16共六個(gè)類型。其中，有些蛋白存在更多的跨膜螺旋預(yù)測(cè)峰形，只是由于峰值的低于80%，不算在其中。采用軟件STRING9.1進(jìn)行在線分析，預(yù)測(cè)的67個(gè)蛋白都具有Sugar_tr結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域?yàn)榧禾禽d體蛋白的特征結(jié)構(gòu)域。

基因MGG_15700、MGG_09307分別在附著胞形成初期和整個(gè)階段表達(dá)量極高；MGG_00040和MGG_03360表達(dá)量呈不斷升高趨勢(shì)；MGG_03620和MGG_06203表達(dá)量在4 h到6 h表達(dá)量有升高，而后持續(xù)下降；其它基因的表達(dá)量在6 h、8 h和14 h之間波動(dòng)?？傊?，根據(jù)附著胞形成階段基因的表達(dá)量高低，可以推測(cè)其是否參與致病過(guò)程，以及在附著胞形成的不同階段所起作用的差異。

預(yù)測(cè)的67個(gè)己糖載體蛋白中，有42個(gè)蛋白的基因在稻瘟病菌侵染水稻的48 h后表達(dá)沒(méi)有明顯上調(diào)，而另外25個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因，可能參與侵染致病過(guò)程。目前已經(jīng)鑒定出的首個(gè)稻瘟病菌己糖載體蛋白基因MGG_03620(MoST1)在侵染階段表達(dá)量不高，表明它可能不參與侵染致病過(guò)程，這與Hiromasa Saitoh等的研究一致，即此基因的敲除不會(huì)影響病菌致病性的變化( Saitohetal., 2014)。當(dāng)然，上述預(yù)測(cè)的己糖載體蛋白的生物學(xué)和生理生化功能還需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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