張晶晶 邵超 陸小軍 葉奕菁

摘要：

目的：探討半枝蓮對AFB1致體外肝細胞毒性的保護作用及其機制。方法：通過采用四甲基偶氮唑（MTT）比色法檢測AFB1對人肝癌細胞株Huh7.5細胞的生長抑制率，再用MTT法觀察半枝蓮作用下AFB1誘導的Huh7.5細胞增殖功能的影響，然后檢測細胞內(nèi)丙二醛含量（ MDA） 、紅細胞超氧化物歧化酶（ SOD）的水平以觀察半枝蓮對AFB1引起的Huh7.5細胞凋亡及脂質(zhì)過氧化損傷的保護作用。結果：AFB1能顯著抑制Huh7.5細胞增殖，IC50為15μg/ mL；而半枝蓮能顯著抑制AFB1暴露細胞的凋亡（P < 0.01）。半枝蓮能明顯降低AFB1作用下肝細胞內(nèi)MDA 含量， 提高其SOD活性， 與對照組比較差異有顯著性（P <0.01）。結論：半枝蓮對AFB1致Huh7.5細胞損傷具有保護作用，其機制與抑制肝細胞凋亡及對抗脂質(zhì)過氧化有關。

關鍵詞：半枝蓮； 黃曲霉毒素（AFB1）；Huh7.5細胞；抗氧化作用

Inhibitory effect of Scutellariae barbata extract on hepatocytes apoptosis and lipid peroxidation induced by aflatoxin B1

Affiliated Zhongshan Hospital of Sun Yat-Sen University，Zhongshan， Guangdong 528403

【Abstract】

Objective：To study the mechanisms by which the Scutellariae barbata extract inhibit AFB1-induced toxicity in human hepatocytes. Methods：The MTT assay was performed to test the inhibitory rate of cell growth induced by AFB1. Then the cell survival effects of Scutellariae barbata extract were measured by using MTT on cells exposed to AFB1. Finally， the concentration of the product of lipid peroxidation malondialdehyde（ MDA） and the activity of superoxide dismutase（ SOD） were measured in Huh7.5 cells. Results：AFB1 exhibited significant cytotoxicity to Huh7.5 cells in dose- and time- dependent manners. Treatment with Scutellariae barbata extract could effectively inhibited the apoptosis of the cell， decrease the concentration of MDA and improve the activity of SOD. Conclution：The extracts of Scutellariae barbata protect HepG2 cells from the cytotoxicity of AFB1 which may relate to the possible underlying mechanisms of anti-apoptosis and antioxidation.

【Key words】Scutellariae barbata； AFB1； Huh7.5 cells； antioxidation

【中圖分類號】

R114 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）05-0002-02

半枝蓮，為唇形科植物半枝蓮的全草，又名韓信草，分布于我國南方各省區(qū)。半枝蓮提取物含有生物堿、黃酮類甙、甾體以及酚類、鞣質(zhì)等。其所含的半枝蓮素，系一種黃酮類化合物（2，5-二羥基-6，7，8-三甲氧基黃酮），此外，還有另兩種黃酮類化合物漢黃苓素（5，7-二羥基-8甲氧基黃酮）和5-羥基-7， 8-二甲氧基黃酮^[1]。體內(nèi)實驗表明，半枝蓮的醇提物對于小鼠肉瘤S180和小鼠肝癌H22細胞抑制其腫瘤增殖活性作用顯著，并且對脾細胞增殖有促進作用^[2]。體外研究也證實半枝蓮可抑制肝癌細胞增殖，并誘導凋亡^[3-5]。但對黃曲霉毒素B1（AFB1）誘導的細胞毒性的保護作用尚未見報到。AFB1是糧食中最常見的真菌毒素，被公認為與HCC發(fā)生密切相關的重要因素之一。研究表明AFB1對肝等主要臟器損傷的原因之一與其造成機體自由基代謝發(fā)生變化有密切的關系。自由基與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展聯(lián)系密切，主要機制是通過生物膜中的多價不飽和脂肪酸的過氧化反應，導致脂質(zhì)過氧化物增多，引起細胞損傷，致使細胞代謝功能障礙，并最終引起器官功能發(fā)生改變^[6]。本試驗旨在研究體外肝細胞加入AFB1后，對細胞增殖功能及抗氧化指標超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的影響，以及半枝蓮對AFB1中毒的拮抗效應，為半枝蓮在臨床上防治黃曲霉毒素B1中毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、藥品及試劑：

Huh7.5細胞株，由本院腫瘤實驗室保存。半枝蓮半購自廣州市藥材公司；AFB1、DMSO、HEPES及MTT為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM 培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品；SOD、MDA試劑盒購于南京建成工程研究所。

1.2 半枝蓮的醇取：

半枝蓮粉碎、過篩，10倍量石油醚回流提取2次，80%乙醇回流提取3次，每次1.5h?；厥杖軇┲脸蓾馑骸?5 g提取物，通過萃取分離。先過濾，留濾渣。使用時用l x PBS稀釋至所需的藥物濃度。

1.3 細胞培養(yǎng)及處理：

人Huh7.5細胞株常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（含10%滅活胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素，PH7.2），置37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，0.1%胰蛋白酶消化傳代。實驗選用對數(shù)生長期細胞。AFB1被溶解在DMSO中，配成1mg/mL的母液。將處于對數(shù)生長期的Huh7.5細胞用0.5%的胰蛋白酶消化，用含胎牛血清的培養(yǎng)基制成5 x 104細胞/mL的懸液，以每孔100μL 接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h。

1.4 AFB1和半枝蓮對Huh7.5細胞增殖的影響：

AFB1組：取Huh7.5細胞（100μL），分別加入含5、10、20、30、40、50μg/mL AFB1的DMEM的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后用MTT法測570 nm 波長處吸光度（A）值，計算AFB1的細胞增殖抑制率（fa）和中效濃度（IC50）。AFB1+半枝蓮組：取Huh7.5細胞（100μL），細胞貼壁后加入不同濃度半枝蓮20ul，使其終濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/ml（原藥材濃度），2h后加入15ug/ml （IC50）每個濃度設3個平行孔、同時設置空白對照組、溶劑對照組和調(diào)零孔，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。應用MTT實驗檢測出半枝蓮對AFB1暴露的Huh7.5細胞存活70%以上的實驗濃度被用于后續(xù)實驗。Huh7.5細胞接種于細胞培養(yǎng)板（6孔板，1×106細胞/ 1mL/孔），每組設3個復孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后細胞被處理如下：（1）Con組：空白對照組；（2）AFB1組：15μg/m L AFB1 （IC50 ）； （3） AFB1+半枝蓮組：15μg/m L AFB1 and 0.125mg/m L半枝蓮。然后細胞被繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h及72h分別用MTT法檢測不同時間點各組細胞的存活率。

1.5 MDA的檢測：

按照“1.3”項下的6孔板分板，作用不同時間（24h、48h及72h）各組細胞被收集，加1 mL PBS制成單細胞懸液，計數(shù)，然后在冰上應用超聲破碎機予200V， 30S， 間隔5S，3次破碎細胞。按試劑盒說明書加樣，以硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA，同時設定空白管、標準空白管及標準管，以532nm單波長檢測MDA吸光度。細胞內(nèi)MDA的含量以nM/106細胞表示。

1.6 細胞內(nèi)SOD的檢測：

按照“1.3”項下的6孔板分板，作用不同時間（24h、48h及72h）各組細胞被收集，PBS漂洗3次，1%TritonX-100 （ PH7.4）裂解液裂解細胞lh，然后離心取上清作為SOD活性測定樣品液，按照試劑盒說明書操作步驟進行，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。細胞內(nèi)SOD的含量以U/106細胞表示。

1.7 統(tǒng)計方法：

試驗結果采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件分析，各組間的顯著性差異用單因素方差分析進行檢驗。結果以平均值±標準差表示，P < 0.05 為顯著性差異。

2 結果

2.1 AFB1對Huh7.5細胞增殖的影響：

MTT法檢測不同濃度的AFB1作用于人肝癌Huh7.5細胞24h后，對細胞增殖的抑制作用（表1，圖1）。結果表明，AFB1能明顯抑制Huh7.5細胞的增殖，并有劑量效應關系。其吸光值A（X±s）與對照組A值相比均有顯著差異（P <0.01），IC50為15μg/m L。

2.2 半枝蓮對AFB1暴露的細胞存活率的影響：

以MTT比色法觀察到半枝蓮對AFB1處理的細胞存活達到60%以上的濃度為0.125mg/mL。以0.125mg/mL半枝蓮預處理后，在24h、48h和72h均提高了AFB1（15μg/m L）暴露細胞的存活率，分別提高了23%、52%及49%（P <0.01），（圖2）。

2.3 半枝蓮降低MDA含量：

MDA是被公認的脂質(zhì)過氧化損傷的標志物。在24h、48h和72h，MDA含量在AFB1組顯著高于空白對照組（P <0.01）；而半枝蓮在3個時間點都明顯抑制了AFB1誘導的MDA的形成（P <0.01），并有時間效應關系（表2）。

3 討論

AFB1通過刺激磷脂A2 引起脂質(zhì)過氧化反應而破壞細胞膜的完整性，繼而AFB1誘導形成活性氧簇（ROS），ROS主要包括超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫等可致DNA鍵斷裂，并與細胞的重要成分起反應，亦可攻擊膜磷脂中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化鏈式反應[6，7]。雙鏈脂肪酸過氧化作用可導致MDA生成增加，抗氧化物消耗增加，清除自由基能力下降，就會加重肝損傷；而且氧化應激所產(chǎn)生的ROS及脂質(zhì)過氧化反應在化學致癌中亦發(fā)揮重要作用。超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于各類生物體中， 能催化生物體內(nèi)超氧自由基（O2- ） 發(fā)生歧化反應， 是機體內(nèi)O2- 的天然消除劑，對機體細胞起保護作用。因此， 機體內(nèi)SOD 在防御O2- 的毒性、抗衰老以及預防腫瘤和抗炎等方面起著重要的生理作用。

人肝癌細胞株，Huh7.5細胞具有相對正常肝細胞的表型。以Huh7.5為細胞模型，本研究顯示AFB1處理后Huh7.5細胞生存率明顯下降，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義；而給予半枝蓮預處理后，Huh7.5細胞的生存率顯著提高，說明一定劑量的半枝蓮對AFB1損傷后的Huh7.5細胞具有保護作用。

氧化損傷是AFB1的細胞毒性及致癌性的潛在機制之一，本研究顯示AFB1處理Huh7.5細胞后，細胞內(nèi)的MDA顯著的增加，這與Hazra^[7]報道一致。這些結果進一步表明AFB1誘導了Huh7.5細胞的氧化應激反應。然而，我們的實驗結果也表明半枝蓮預處理明顯增加了AFB1暴露細胞的活力并有效阻滯了AFB1誘導的MDA的形成，這表明半枝蓮明顯抑制了AFB1誘導的細胞毒性。

在正常生理條件下，有機體的抗氧化系統(tǒng)能夠有效的清除氧化應激所導致的氧化損傷；一旦這種平衡被打破就會導致一系列的氧化損傷，進而產(chǎn)生病理性的改變。有機體的抗氧化防御系統(tǒng)一般有四個方面的功能：①抑制ROS的產(chǎn)生；②清除ROS；③清除、恢復或重建損傷的部分；④誘導抗氧化物酶的產(chǎn)生^[8]。半枝蓮是標準化的制劑，是黃酮類的化合物。研究表明黃酮類是過氧化物及羥自由基的清除劑，并能有效的抑制脂質(zhì)過氧化反應^[9]。我們的實驗沒有限定半枝蓮的單體成分，因為半枝蓮的活性可能是歸功于它特殊的組份，或者是它的兩種或更多種組份同時在起作用。黃酮類主要的化學結構包括芳香環(huán)和雙鍵能夠與ROS發(fā)生反應，可以直接清除自由基；而且黃酮類具有羥基石炭酸的結構可以和Fe2+螯合，間接抑制自由基的形成。我們的結果與Yao^[10]報道相符。

總之，我們的實驗表明AFB1誘導了Huh7.5的氧化應激反應。抗氧化物半枝蓮預處理有效阻滯了AFB1誘導的Huh7.5的毒性，其機制部分可能與降低細胞內(nèi)MDA的水平，提高SOD活性有關，其保護作用機制有待進一步研究。

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