趙紅珂莫凌昭

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

基礎(chǔ)研究

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因小片段干擾RNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其在子宮頸癌caski細(xì)胞的表達(dá)

趙紅珂△莫凌昭

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

目的 構(gòu)建及鑒定攜帶沉默人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）慢病毒（lentivirus，LV）表達(dá)載體，并觀察其在子宮頸癌caski細(xì)胞的表達(dá)情況。方法 以Designer3.0（Genepharma）軟件設(shè)計(jì)靶向hTERT基因特異性的小片段RNA（shRNA）干擾序列，將hTERT-shRNA基因片段插入重組慢病毒pGLV3/H1/GFP+Puro，構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒LV3-shRNA-hTERT，酶切、DNA測(cè)序驗(yàn)證hTERT片段準(zhǔn)確性。LV3-shRNA-hTERT與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，濃縮上清液并測(cè)定病毒滴度獲得重組慢病毒后感染caski細(xì)胞。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（未感染病毒的caski細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（感染空載病毒LV3-shNC的caski細(xì)胞）和hTERT干擾組（感染攜帶LV3-shhTERT慢病毒的caski細(xì)胞）。綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)判斷轉(zhuǎn)染結(jié)果并估計(jì)轉(zhuǎn)染效率，流式細(xì)胞術(shù)儀檢測(cè)病毒感染率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（qRT-PCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后基因hTERT mRNA的表達(dá)情況，CCK-8法檢測(cè)caski細(xì)胞增殖情況。結(jié)果 將目的序列成功連接到載體上，并經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)載體構(gòu)建成功；成功包裝成高滴度的慢病毒，且能有效感染子宮頸癌caski細(xì)胞。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)構(gòu)建的hTERT-小片段干擾RNA慢病毒表達(dá)載體可顯著抑制hTERT基因的表達(dá)。hTERT干擾組細(xì)胞增殖受抑制，生長(zhǎng)速度較陰性對(duì)照組生長(zhǎng)緩慢。結(jié)論 成功構(gòu)建了攜帶hTERT-shRNA慢病毒表達(dá)載體LV3-shRNA-hTERT，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子宮頸癌caski細(xì)胞。該載體能夠有效抑制hTERT的表達(dá)，使子宮頸癌caski細(xì)胞增殖緩慢，為進(jìn)一步探討hTERT基因在子宮頸癌的發(fā)病機(jī)制和體外基因干預(yù)治療奠定基礎(chǔ)。

子宮頸腫瘤；人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因；慢病毒載體；小片段RNA；caski細(xì)胞

子宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居于我國(guó)女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位，發(fā)展中國(guó)的家的發(fā)病率高于發(fā)達(dá)國(guó)家［1］。調(diào)查顯示，子宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中高危型人乳頭狀瘤病毒，如HPV16及HPV18等病毒的持續(xù)感染為重要的關(guān)鍵致病因素［2］。高危型HPV E6蛋白誘導(dǎo)并維持子宮頸癌細(xì)胞的端粒酶表達(dá)［3］，可見端粒酶為一種重要的靶蛋白。端粒酶是一種細(xì)胞RNA依賴的DNA聚合酶，能夠維持細(xì)胞染色體末端端粒長(zhǎng)度。調(diào)節(jié)端粒酶活性的限速因素是端粒酶的催化亞單位—人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）［4］。端粒酶作為惡性腫瘤標(biāo)志物已被認(rèn)可，但端粒酶抑制劑可否作為抗腫瘤藥物仍未知，以端粒酶為靶點(diǎn)篩選新的抗腫瘤藥物成為目前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一［5］。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是小片段干擾 RNA（small interference RNA，siRNA）在轉(zhuǎn)錄后mRNA水平關(guān)閉靶基因表達(dá)的現(xiàn)象［6］。干擾hTERT基因在子宮頸癌caski細(xì)胞的表達(dá)能否作為子宮頸癌基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)有待研究。本研究利用RNAi技術(shù)，構(gòu)建干擾hTERT基因重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入該基因高表達(dá)的子宮頸癌caski細(xì)胞中，進(jìn)一步觀察hTERT對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，以期為研究hTERT與子宮頸癌的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

子宮頸癌caski細(xì)胞株和人胚胎腎上皮293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，感受態(tài)大腸桿菌DH-5α、質(zhì)粒 pGLV3/H1/GFP+Puro、Polybrene和 RNAi-Mate轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海吉瑪基因有限公司。限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購(gòu)自日本TaKaRa公司，Trizol購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，PCR引物合成、測(cè)序、慢病毒重組穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G的制備均為上海吉瑪基因有限公司。

1.2 表達(dá)hTERT-shRNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建

1.2.1 hTERT-shRNA的設(shè)計(jì) 根據(jù) GeneBank中hTERT的mRNA序列（NM198253），參照siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則［7］，應(yīng)用siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)軟件Oligo Designer3.0（Genepharma），設(shè)計(jì)并篩選出一個(gè)有效的靶位點(diǎn)：GCTTCCTCAGGAACACCAAGA，另行設(shè)計(jì)一條無(wú)效序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT，對(duì)所選序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析（Blast分析、SNP分析）。

1.2.2 慢病毒載體的構(gòu)建及包裝 ⑴LV3-hTERT-shDNA模板的退火。將DNA oligo分別用TE（pH8.0）溶解，濃度為100 μmol/L。取相應(yīng)的正義鏈和反義鏈

oligo溶液，按照配比配置退火反應(yīng)體系。⑵LV3載體的線性化。取10 μg LV3載體，37℃酶切1 h，電泳后DNA凝膠回收試劑盒回收，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。⑶LV3-hTERT-shDNA載體的構(gòu)建。反應(yīng)體系10×T4連接緩沖液2 μl，載體LV3（BamHI+EcoRI）1 μl，shDNA模板（100 μmol/L）1 μl，T4 DNA連接酶（5 weissU/μl）1 μl，水15 μl，Total 20，22℃1 h，進(jìn)行載體連接。⑷感受態(tài)細(xì)胞的制備，用氯化鈣法。⑸連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。解凍后的感受態(tài)細(xì)胞加10 μl連接產(chǎn)物，冰敷30 min。42℃水浴90 s，冷卻3 min。加入800 μl LB培養(yǎng)基，37℃搖床，250 r/min離心45 min后細(xì)菌復(fù)蘇。取200 μl培育后的細(xì)胞均勻涂布于含50 μg/ml Ampi-cillin LB平板上。倒置平板于37℃培養(yǎng)16 h。⑹陽(yáng)性克隆的鑒定與測(cè)序。使用堿裂解法抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用EcoRI進(jìn)行單酶切鑒定，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3 慢病毒濃縮和收集 對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)85%～95%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，接種于3個(gè)15 cm培養(yǎng)皿中，每皿加9 ml 10%FBS+DMEM培養(yǎng)過(guò)夜。將已準(zhǔn)備好的質(zhì)粒與無(wú)血清DMEM、RNAi-Mate按比例混勻后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10 h后，棄去上清液，再加入新鮮的10%FBS+DMEM，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。轉(zhuǎn)染72 h后，將培養(yǎng)皿細(xì)胞上清液收集離心，濃縮液分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病毒滴度測(cè)定 培養(yǎng)細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)消化細(xì)胞，用培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液。接種于96孔板中，混勻后培養(yǎng)24 h，然后用10倍稀釋法將慢病毒稀釋成3～5個(gè)梯度，每個(gè)孔加入100 μl稀釋好的病毒液進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后棄去病毒液，加入含有10%血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，通過(guò)熒光顯微鏡計(jì)數(shù)有熒光的細(xì)胞數(shù)，結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度。病毒滴度（IU/ml）=（熒光細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比×接種細(xì)胞數(shù)/100×接種細(xì)胞體積）×1/稀釋倍數(shù)。

1.3 子宮頸癌caski細(xì)胞的培養(yǎng)

將人子宮頸癌caski細(xì)胞置于含15%胎牛血清及1%青霉素（或鏈霉素）的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、80%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.4 病毒介導(dǎo)法將重組慢病毒感染caski細(xì)胞

caski細(xì)胞為HPV 16陽(yáng)性的子宮頸癌細(xì)胞株；LV3-shNC為無(wú)目的基因的真核表達(dá)載體；LV3-shhTERT為HPV16 hTERT特異性siRNA表達(dá)載體。采用病毒介導(dǎo)法（逆轉(zhuǎn)錄病毒）將空載病毒LV3-shNC和攜帶LV3-shhTERT慢病毒分別以感染復(fù)數(shù)（MOI）為20和10感染子宮頸癌caski細(xì)胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中感染8～10 h后，更換含有10%血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d使病毒基因可整合到宿主細(xì)胞基因組，熒光顯微鏡下觀察熒光數(shù)量以判斷感染率。實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組（未感染病毒的caski細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（感染空載病毒LV3-shNC的caski細(xì)胞）、hTERT干擾組（感染攜帶LV3-shhTERT慢病毒的caski細(xì)胞）。

1.5 有效干擾序列的篩選

將轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞消化至培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用已確定篩選濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)液進(jìn)行抗性篩選，每周換液2～3次，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。篩選14 d后將留下的抗性克隆團(tuán)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集抗性克隆形成后1周的細(xì)胞。取部分細(xì)胞以流式細(xì)胞術(shù)儀檢測(cè)熒光感染率，判斷病毒的感染率。

1.6 qRT-PCR法檢測(cè)hTERT mRNA的水平

常規(guī)法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR法檢測(cè)hTERT mRNA的表達(dá)。hTERT基因引物：上游引物為5′-CTCCCATTTCATCAGCAAGTTT-3′，下游引物為5′-CTTGGCTTTCAGGATGGAGTAG-3′。GAPDH內(nèi)對(duì)照引物：上游引物為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’，引物均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。擴(kuò)增條件為95℃3 min，95℃12 s，62℃40 s，40個(gè)循環(huán)，25℃ 45 min退火。實(shí)驗(yàn)設(shè)3組，每項(xiàng)重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。用2-△△Ct法計(jì)算各組目標(biāo)基因mRNA模板的相對(duì)差異。△△Ct=［Ct（實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因）-Ct（實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因）］-［Ct（實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因）-Ct（實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因）］，2-△△Ct=mRNA模板量的比值。

1.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

將3組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞生長(zhǎng)接近80%的融合度時(shí)，用0.25%胰酶消化，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后在96孔板中每孔加入2 000個(gè)細(xì)胞，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件加培養(yǎng)液，每孔總體積為200 μl，共接種5個(gè)板，每塊板都設(shè)空白組、NC-LV組、anti-htert-LV組，每組5個(gè)副孔，十字搖勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液。繼之在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，以酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（OD值），以各組OD值計(jì)算細(xì)胞生存率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示，兩組資料的比較用t檢驗(yàn)；多組間的比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組hTERT質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，針對(duì)hTERT基因的shRNA鏈與質(zhì)粒pGLV3/H1/GFP+Puro連接成功。結(jié)果符合設(shè)計(jì)要求，表明實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了針對(duì)hTERT的shRNA質(zhì)粒。見圖1。

圖1 慢病毒載體測(cè)序結(jié)果

2.2 慢病毒滴度測(cè)定結(jié)果

熒光顯微鏡觀察顯示，熒光細(xì)胞數(shù)目隨病毒液的稀釋倍數(shù)增加而逐步減少，按逐孔稀釋滴度測(cè)定法測(cè)定其滴度為1×109TU/ml。見圖2。

圖2 不同稀釋濃度的病毒原液侵染caski細(xì)胞的熒光表達(dá)（×40）

2.3 流式細(xì)胞術(shù)儀檢測(cè)感染率

從目的細(xì)胞感染預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得caski細(xì)胞的MOI值為20，用一定濃度的嘌呤霉素篩選14 d后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)儀檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株熒光率為95%以上，達(dá)到本實(shí)驗(yàn)要求，可進(jìn)行下游慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾試驗(yàn)。見圖3、圖4。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)hTERT mRNA的相對(duì)表達(dá)量

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)hTERT mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果轉(zhuǎn)染后hTERT干擾組細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)量為0.97±0.053，明顯低于空白對(duì)照組的1和陰性對(duì)照組的0.28±0.022（P＜0.05）；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.6944，P＞0.05）。見圖5。

2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示：陰性對(duì)照組和hTERT干擾組感染后48 h、72 h、96 h，caski細(xì)胞的OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。根據(jù)3組細(xì)胞OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示hTERT干擾組細(xì)胞生長(zhǎng)速度較陰性對(duì)照組緩慢，細(xì)胞增殖受到抑制；而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致。見圖6。

圖3 慢病毒感染caski細(xì)胞后用嘌呤霉素曬選后的熒光及常光照片（×40）

圖4 流式細(xì)胞術(shù)儀分別測(cè)定慢病毒感染后的轉(zhuǎn)染率及嘌呤霉素篩選后的感染率

圖5 感染慢病毒后hTERT mRNA的表達(dá)

表1 不同感染時(shí)間hTERT干擾組與陰性對(duì)照組子宮頸癌caski細(xì)胞OD值的比較（s）

表1 不同感染時(shí)間hTERT干擾組與陰性對(duì)照組子宮頸癌caski細(xì)胞OD值的比較（s）

感染后的時(shí)間（h）組別24 48 72 96陰性對(duì)照組 0.299±0.002 0.554±0.010 0.805±0.014 hTERT干擾組 0.301±0.008 0.356±0.007 0.396±0.013 0.475±0.008 t 0.408 10.317 19.076 41.610 P 0.697 ＜0.05 ＜0.001 ＜0.001 0.419±0.010

圖6 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組子宮頸癌caski細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

3 討論

在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中端粒酶具有重要意義，端粒酶RNA、相關(guān)蛋白和hTRET是組成人端粒酶的3種主要成分。臨床數(shù)據(jù)表明，正常組織及大多數(shù)良性病變組織中端粒酶不表達(dá)或低表達(dá)，但90%以上的惡性腫瘤組織中端粒酶活性表達(dá)較高［8］，而具有端粒酶活性的惡性腫瘤細(xì)胞均有hTERT的表達(dá)［9］。hTERT可能是特異性抑制腫瘤的良好靶點(diǎn)［10］，當(dāng)前以hTERT為靶點(diǎn)的RNA干擾基因沉默成為惡性腫瘤基因治療研究的熱點(diǎn)之一。有報(bào)道子宮頸癌組織中中可檢測(cè)到大量hTERT的表達(dá)［11］。為進(jìn)一步研究hTERT在子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建成功的hTERT-shRNA慢病毒表達(dá)載體感染子宮頸癌caski細(xì)胞，用CCK-8法檢測(cè)hTERT-shRNA對(duì)caski細(xì)胞增殖活力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)hTERT干擾組感染后48 h、72 h、96 h細(xì)胞生長(zhǎng)均較陰性對(duì)照組緩慢，提示細(xì)胞增殖受抑制，與莫小亮的報(bào)道結(jié)果一致［12］。

目前基因治療已成為腫瘤治療研究的焦點(diǎn)，而基因轉(zhuǎn)染載體主要分為非病毒載體和病毒載體兩大類。非病毒載體特異性差、轉(zhuǎn)染率低且不能長(zhǎng)久表達(dá)；病毒載體有反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和慢病毒等。研究發(fā)現(xiàn)，惟有慢病毒載體能高效感染分裂期和非分裂期細(xì)胞,并把基因高效整合到靶細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)持久表達(dá)［13］。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的一個(gè)亞類，能夠攜帶目的基因高效整合到宿主細(xì)胞染色體中，不易引起突變，且不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，能夠穩(wěn)定表達(dá)，具有較好的生物安全性，是一種理想的基因轉(zhuǎn)移載體［14］。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)子宮頸癌進(jìn)行基因治療［15］，有研究人員曾應(yīng)用核酶和反義核酸等技術(shù)干擾基因的表達(dá)，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性差、效率低且作用時(shí)間短暫，很難降解或敲除目的基因抑制［16，17］。RNAi是一種具有21Pb的序列特異的雙鏈RNA（double-strandedRNA,dsRNA）在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)或使其沉默的過(guò)程. siRNA能高效導(dǎo)入細(xì)胞并且達(dá)到高效的基因沉默，其所需要的劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于核酶和反義核酸，具有高特異性、高效率、高成功率的特點(diǎn)，在腫瘤、病毒感染、遺傳病及其他疾病的基因治療中均有巨大潛力［18］，已經(jīng)開始應(yīng)用于一些疾病臨床治療的研究［19～22］，為特異性、個(gè)體化基因治療以及腫瘤發(fā)病分子機(jī)制的研究提供新的技術(shù)手段［23］。有報(bào)道直接轉(zhuǎn)染合成的siRNA雖能特異抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)同源基因的表達(dá),有效抑制癌基因的表達(dá)［24］,但細(xì)胞內(nèi)siRNA很容易被降解［9］，難以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的RNAi。為此,本研究采用慢病毒載體進(jìn)行RNAi研究,與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的普通siRNA載體相比，本研究構(gòu)建的siRNA慢病毒載體不僅可以替代瞬時(shí)表達(dá)載體擴(kuò)增使用，而且還可感染傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，如處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、原代細(xì)胞等，并整合入受感染細(xì)胞基因組內(nèi)而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定地長(zhǎng)期表達(dá)，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)更為確切地觀察結(jié)果奠定基礎(chǔ)。

為成功構(gòu)建hTERT-shRNA慢病毒表達(dá)載體，進(jìn)一步闡明子宮頸癌發(fā)病與hTERT的關(guān)系，本研究利用RNAi技術(shù)設(shè)計(jì)和構(gòu)建了針對(duì)靶基因hTERT的shRNA表達(dá)重組體，并經(jīng)過(guò)第三代慢病毒pGLV3/H1/ GFP+Puro質(zhì)粒載體包裝、濃縮、收集病毒液，將構(gòu)建成功的慢病毒載體感染子宮頸癌caski細(xì)胞，通過(guò)觀測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)判斷轉(zhuǎn)染成功與否以及估計(jì)轉(zhuǎn)染效率，方法且簡(jiǎn)單、易行，干擾高效、特異性強(qiáng)且效果穩(wěn)定。感染72～96 h后熒光顯微鏡下觀查熒光表達(dá)及轉(zhuǎn)染情況，嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定的細(xì)胞株，流式細(xì)胞術(shù)儀測(cè)定轉(zhuǎn)染率高達(dá)95%以上，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)量明顯降低。另外，本研究進(jìn)一步用CCK-8法檢測(cè)hTERT-shRNA對(duì)子宮頸癌caski細(xì)胞增殖能力的影響，沉默hTERT后的hTERT干擾組caski細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體，并建立anti-hTERT-LV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，有望為進(jìn)一步深入探討子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供新的特異性基因治療靶點(diǎn)和技術(shù)，也為子宮頸癌的基因治療應(yīng)用于臨床奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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［2014-10-14收稿］［2014-11-26修回］［編輯 羅惠予］

Construction of a plasmid expressing small hairpin RNA against human telomerase reverse transcriptase and functional analysis in the caski cervical cancer line

ZHAO Hong-ke△，MO Ling-zhao（Department of Gynecological Oncology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；△Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

MO Ling-zhao.E-mail：molingzhao@hotmail.com

Objective To construct a plasmid expressing a small hairpin RNA（shRNA）to knockdown expression of human telomerase reverse transcriptase（hTERT），and to observe its effects on hTERT expression in caski cervical cancer cells.Methods Designer 3.0 software（Genepharma）was used to design an shRNA targeting hTERT.The shRNA was cloned into the pGLV3/Hi/GFP+Puro vector and confirmed by sequencing.Cells were divided into blank control group，negative control group and hTERT interference group.The resulting plasmid was transfected into caski cervical cancer cells and expression of the GFP reporter was analyzed.In addition，expression of chromosomal hTERT mRNA was quantified using RT-PCR.Cell proliferation in the presence and absence ofshRNA was measured using the cck-8 assay.Results A plasmid expressing an shRNA targeting hTERT was constructed and used to generate recombinant lentivirus.Lentiviral infection of caski cells led to lower expression of hTERT mRNA and slower cell proliferation than in controls.Conclusion A plasmid expressing shRNA targeting hTERT can effectively knockdown endogenous hTERT expression.This reagent may prove useful for understanding the role of telomerase in the pathogenesis of cervical cancer.

Cervical neoplasm；Human telomerase reverse transcriptase gene（hTERT）；Lentivirus-based vectors；Small hairpin RNA；Caski cell

R737.33

A

1674-5671（2014）04-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.04.05

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2013GXNSFAAO19254）

莫凌昭。E-mail：molingzhao@hotmail.com