任民柱

作者單位：453000 新鄉(xiāng) 河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院放療科

臨床研究

食管鱗癌組織中骨橋蛋白的表達(dá)及其臨床意義

任民柱

作者單位：453000 新鄉(xiāng) 河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院放療科

目的 研究骨橋蛋白（osteopontin，OPN）在食管鱗癌患者組織中的表達(dá)及臨床意義。方法分別選取120例食管鱗癌癌組織、46例癌旁不典型增生組織和120例正常食管黏膜組織，分別用免疫組化法檢測各種組織中OPN蛋白的表達(dá)情況，并分析其臨床意義。 結(jié)果 在食管鱗癌癌組織、癌旁不典型增生組織和正常食管黏膜組織中，OPN的陽性表達(dá)率分別為76.67%（92/120）、34.78%（16/46）和0（0/120）。食管鱗癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌組織的浸潤深度均與OPN蛋白的陽性表達(dá)明顯相關(guān)（P均＜0.05）。食管鱗癌組織中OPN蛋白陽性表達(dá)組與陰性表達(dá)組患者的5年生存率分別為10.7%及28.6%（P＜0.05）。 結(jié)論 OPN蛋白在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起到十分重要的作用，檢測OPN蛋白的表達(dá)具有重要臨床意義。

食管腫瘤；骨橋蛋白；臨床意義

河南省北部是我國食管癌的高發(fā)區(qū)，近年來該病的發(fā)病率及生存率均無明顯下降。因此，制定有效的預(yù)防和治療方案，尋找能夠提示食管癌發(fā)病和判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物可能有助于提高治療的有效率以及患者生存率。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是人體內(nèi)重要的鈣結(jié)合性磷酸化糖蛋白，在腫瘤發(fā)生及發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)中，OPN起到十分重要的作用。本實(shí)驗(yàn)探討OPN在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況，并分析OPN的表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

120例均為河南新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院2007年6月至2008年12月收治的食管鱗癌患者，男性56例，女性64例，年齡43～77歲，平均年齡62.05歲。分別采集每例患者食管鱗癌癌組織、癌旁不典型增生組織（距腫瘤組織邊緣3 cm以內(nèi)）和正常食管黏膜組織（距腫瘤組織3 cm以上）。術(shù)前所有患者均無放化療和其他治療史。截至2013年12月31日，共隨訪完整資料患者107例。13例患者因多種原因失訪。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

首先在光學(xué)顯微鏡下將全部標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)診斷，然后篩選出120例食管鱗癌癌組織、46例癌旁不典型增生組織、120例食管手術(shù)殘端（距腫瘤組織3 cm以上）正常食管黏膜組織。隨后按正常的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行免疫組化二步法，石蠟脫蠟水化，抗原修復(fù)，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。OPN用己知陽性的組織作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。OPN兔抗人多克隆抗體和免疫組化試劑盒均購于福州邁新試劑公司。

1.3 結(jié)果判定

染色結(jié)果由2名病理科醫(yī)生分別獨(dú)立觀察所有切片，結(jié)果不一致時(shí)，采取協(xié)商統(tǒng)一的原則。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)均染成棕褐色或棕黃色者判定為陽性細(xì)胞。⑴按細(xì)胞質(zhì)的染色強(qiáng)度計(jì)分：無著色計(jì)1分，染成淡黃色計(jì)2分，染成棕黃色計(jì)3分；⑵按陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：小于或等于總數(shù)的25%計(jì)1分，25%～75%計(jì)2分，大于75%計(jì)3分。以上兩者得分相乘，大于7分為陽性，小于7分為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。χ2檢驗(yàn)用于計(jì)數(shù)資料的分析比較，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法，Log-rank檢驗(yàn)用于組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OPN蛋白在食管鱗癌各種組織中的陽性表達(dá)

在食管鱗癌癌組織中OPN蛋白的表達(dá)明顯，其陽性表達(dá)率為76.67%（92/120）；在癌旁不典型增生組織中OPN蛋白也有不同程度的表達(dá)，其陽性表達(dá)率為34.78%（16/46）；在正常食管黏膜組織中OPN蛋白的表達(dá)缺失（0/120）。細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為免疫組化染色的陽性部位，見圖1。OPN蛋白在正常食管黏膜組織、癌旁不典型增生組織及食管鱗癌癌組織中表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 OPN蛋白在食管鱗癌癌組織、癌旁不典型增生組織和正常食管黏膜組織中的表達(dá)（n）

圖1 OPN蛋白在食管鱗癌癌組織、癌旁不典型增生組織中的陽性表達(dá)（SP×100）

2.2 OPN蛋白在食管鱗癌癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

⑴在食管鱗癌癌組織中腫瘤未侵及外膜（T1、T2）者OPN蛋白的陽性表達(dá)率為52.38%（22/42），侵及外膜以外區(qū)域（T3、T4）者的陽性表達(dá)率為89.74%（70/78）（P＜0.05）；⑵在食管鱗癌癌組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者OPN蛋白的陽性表達(dá)率為96.55%（56/58），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的陽性表達(dá)率為58.06%（36/62）（P＜0.05）。⑶TNM分期為早期（玉期+Ⅱ期）者OPN的陽性表達(dá)率為61.11%（44/72），晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）者的陽性表達(dá)率為100%（48/48）（P＜0.05）。OPN蛋白的表達(dá)率與患者性別、年齡、腫瘤直徑及分化程度等均無關(guān)（P均＞0.05）。見表2。

2.3 OPN蛋白的陽性表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

經(jīng)Kaplan-Meier單因素生存分析，結(jié)果顯示食管鱗癌癌組織中OPN蛋白陽性表達(dá)患者的5年生存率明顯低于OPN陰性表達(dá)的患者（分別為10.7%及28.6%），經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.325，P＜0.05），提示OPN蛋白的表達(dá)與食管鱗癌患者的生存率有關(guān)。其生存曲線見圖2。

表2 OPN蛋白在食管鱗癌癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（n）

圖2 食管鱗癌癌組織中OPN蛋白表達(dá)陽性組與OPN蛋白表達(dá)陰性組患者的生存曲線

3 討論

OPN是分子量為441kD的分泌型糖基化磷蛋白，是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)非膠原蛋白，由近300個(gè)氨基酸殘基組成，其中絲氨酸、天門冬氨酸及谷氨酸殘基占很高的比例。在細(xì)胞外基質(zhì)的非膠原蛋白中起到非常重要的作用。OPN具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，可以通過與磷脂酞肌醇3激酶信號途徑中的蛋白激酶B的結(jié)合，調(diào)節(jié)體內(nèi)物質(zhì)代謝，抑制細(xì)胞凋亡［1］，同時(shí)OPN還有促進(jìn)腫瘤血管增生和免疫調(diào)節(jié)的作用［2，3］，從而進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。OPN的受體家族包括CD44受體和整合素受體，CD44受體是黏附分子，主要介導(dǎo)細(xì)胞與基質(zhì)以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。由于OPN蛋白中的RGD（Arg-Gly-Asp，RGD）序列容易與整合素受體結(jié)合，之后再與CD44結(jié)合，介導(dǎo)成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的趨化作用與黏附作用，結(jié)果顯著提高腫瘤細(xì)胞的黏附能力，從而引起癌組織中OPN陽性率升高［4］。有研究顯示在胃癌組織中OPN蛋白的陽性表達(dá)率為72.5%（29/40），且隨腫瘤病理分級的升高其陽性表達(dá)率也升高［5］。這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。OPN蛋白在食管鱗癌癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁不典型增生組織和正常食管黏膜組織。腫瘤TNM分期與OPN蛋白的表達(dá)水平密切相關(guān)，食管鱗癌癌組織分期越晚，OPN蛋白的表達(dá)越高。

另外，本研究結(jié)果表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與OPN蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者OPN蛋白的表達(dá)明顯升高。表明OPN蛋白表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞較陰性者具有更高的轉(zhuǎn)移潛能，可趨向性地運(yùn)動到其他相鄰淋巴結(jié)及器官，形成更多的轉(zhuǎn)移灶。

本研究結(jié)果顯示食管鱗癌組織浸潤越深，OPN蛋白的表達(dá)越高。這是因?yàn)樵谀[瘤浸潤、轉(zhuǎn)移過程中OPN發(fā)揮了重要的作用，特別是在具有侵襲和轉(zhuǎn)移特性的腫瘤細(xì)胞中其表達(dá)尤為明顯［6］。張惠忠等［7］的研究顯示在食管鱗癌癌組織中OPN的陽性表達(dá)率為100%（80/80），與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分化程度都有密切關(guān)系。本研究中OPN蛋白在低分化食管鱗癌的表達(dá)高于中-高分化者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），分析可能與樣本量較小有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)顯示在食管鱗癌發(fā)展過程中可能會伴隨OPN的過度表達(dá)，表現(xiàn)為超出常規(guī)的分化、過度增殖和凋亡極度減少，進(jìn)一步引起腫瘤細(xì)胞增殖和分化出現(xiàn)異常，產(chǎn)生癌變，從而引起腫瘤的發(fā)生。

有研究顯示，OPN蛋白表達(dá)陽性的乳腺癌、胃癌及肝癌患者，其生存率均低于陰性表達(dá)組的患者［8～10］。劉金耿等［11］報(bào)道食管癌中OPN蛋白的表達(dá)水平越高，患者的術(shù)后生存時(shí)間越短，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果基本一致。我們認(rèn)為，隨著食管腫瘤的發(fā)展，OPN蛋白高表達(dá)的細(xì)胞更趨向惡性的生物學(xué)行為，表現(xiàn)為具有更強(qiáng)的侵襲性和更差的預(yù)后。目前，關(guān)于OPN與食管癌預(yù)后的相關(guān)報(bào)道相對較少，還沒有一致認(rèn)同的結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示食管鱗癌患者中OPN蛋白表達(dá)陽性的患者比陰性表達(dá)者有更低的5年生存率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

OPN蛋白及其受體能被其抗體或合成的多肽所抑制，OPN的受體CD44已被用作多種腫瘤治療的靶點(diǎn)，故OPN蛋白在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，在目前尚缺乏有效預(yù)測食管癌預(yù)后指標(biāo)的背景下，OPN的檢測將提供一個(gè)新的思路和方法。

［1］ Lin YH，Yang-Yen HF.The osteopontin-CD44 survival signal involves activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway［J］.J Biol Chem，2001，276（49）：46024-46030.

［2］ Hirama M，Takahashi F，Takahashi K，et al.Osteopontin overproduced by tumor cells acts as a potent angiogenic factor contributing to tumor growth［J］.Cancer Lett，2003，198（1）：107-117.

［3］ 任民柱，楊留勤.骨橋蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制［J］.實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2010，24（2）：186-189.

［4］ Oldberg A，F(xiàn)ranzen A，Heinegard D.Cloning and sequence analysis of rat bone sialoprotein（osteopontin）cDNA reveals an Arg-Gly-Asp cell-binding sequence［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1986，83（23）：8819-8823.

［5］ Ue T，Yokozaki H，Kitadai Y，et al.Co-expression of osteopontin and CD44v9 in gastric cancer［J］.Int J Cancer，1998，79（2）：127-132.

［6］ 黃天臣，邱新光.血清骨橋蛋白檢測對預(yù)測胃癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的意義［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，34（2）：280-284.

［7］ 張惠忠，劉金耿，魏益平，等.食管鱗癌RhoC和OPN蛋白的表達(dá)及其對患者預(yù)后的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006，26（11）：1612-1615.

［8］ 漆楚波，王明偉，龔益平，等.骨橋蛋白對乳腺癌預(yù)后的判斷價(jià)值［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2013，29（5）：482-485.

［9］ 唐曦，沈錫中，王吉耀，等.骨橋蛋白與胃癌預(yù)后的關(guān)系［J］.中華消化雜志，2007，27（11）：741-744.

［10］姜偉棟，印芳穎，韓喜春，等.骨橋蛋白在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系［J］.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2007，11（3）：307-308.

［11］劉金耿，張惠忠，魏益平，等.食管鱗癌G3BP和骨橋蛋白的表達(dá)及其對患者預(yù)后的影響［J］.中華胃腸外科雜志，2007，10（1）：73-76.

［2014-08-16收稿］［2014-09-15修回］［編輯 阮萃才］

Expression and clinical significance of osteopontin in esophageal squamous carcinoma

Ren Min-zhu（Department of Radiotherapy，Xinxiang Centre Hospital of Henan Province，Xinxiang 453000，P.R.China）

Objective To analyze the expression and clinical significance of osteopontin（OPN）in esophageal carcinoma.Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of OPN in normal esophageal tissue and in 120 specimens of esophageal carcinoma tumor tissue and tumor-adjacent tissue showing atypical hyperplasia.Results OPN expression density was lowest in normal esophageal tissues（0），higher in tumor-adjacent tissues showing atypical hyperplasia（34.78%）and highest in esophageal carcinoma tissues（76.67%）.Expression of OPN protein correlated with tumor TNM stage，lymph node metastasis and infiltrative depth of esophageal squamous cell carcinoma（P＜0.05）.The five-year survival rate was significantly higher in patients negative for OPN expression than in those positive for OPN expression（28.6%vs 10.7%，P＜0.05）.Conclusion Studying OPN expression may generate insights into the pathogenesis，invasion and metastasis of esophageal carcinoma，and it may provide tools for predicting the prognosis of patients with the disease.

Esophageal neoplasm；Osteopontin；Clinical significance

R735.1

A

1674-5671（2014）04-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.04.13