蒙夢蘭 玉艷紅 黃力毅 吳繼周

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病科

臨床研究

肝癌與肝炎患者肝內(nèi)人纖維介素的表達及意義

蒙夢蘭 玉艷紅 黃力毅 吳繼周

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病科

目的 探討輕度、中度、重度慢性乙型肝炎及肝癌患者肝組織內(nèi)人纖維介素（又稱人纖維蛋白原樣2凝血酶原酶，human fibrinogen-like protein 2 prothrombnase，hFgl 2）的表達及其與患者血清轉(zhuǎn)氨酶（ALT、AST）、膽紅素（TBIL）、血漿凝血酶原時間（PT）等指標(biāo)的相關(guān)性，并分析其意義。方法 對14例輕度慢性乙型肝炎、13例中度慢性乙型肝炎、8例重度慢性乙型肝炎及22例肝癌患者，應(yīng)用免疫組化方法分別檢測其肝炎組織及肝癌組織內(nèi)hFgl 2的表達，使用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析軟件測定hFgl 2的表達水平。結(jié)果 hFgl 2在重度慢性乙型肝炎組及肝癌組的表達均高于輕度及中度慢性乙型肝炎組（P均＜0.05）。慢性乙型肝炎組患者肝組織內(nèi)hFgl 2蛋白的表達水平與患者血清ALT、AST的水平呈正相關(guān)（P＜0.001），在肝癌組中hFgl 2的表達水平與患者PT、ALT、AST、TBIL均無相關(guān)性（P均＞0.05）。結(jié)論 肝癌和重度慢性乙型肝炎患者肝內(nèi)人纖維介素呈高表達，在慢性乙型肝炎中其水平與肝細胞破壞嚴重程度相關(guān)，而在肝癌中則無相關(guān)性，提示人纖維介素在肝癌中的作用可能不同于慢性乙型肝炎。

肝腫瘤；人纖維介素；慢性乙型肝炎；肝組織；表達

人纖維介素又稱人纖維蛋白原樣2凝血酶原酶（human fibrinogen-like protein 2 prothrombinase，hFgl 2），是一種新發(fā)現(xiàn)的凝血因子，能夠直接激活凝血酶原，啟動凝血反應(yīng)［1］。有研究顯示hFgl 2在多種腫瘤如結(jié)腸癌、子宮頸癌、乳腺癌等癌組織內(nèi)［2］以及肝炎患者外周血單核細胞中高表達，且其在肝炎外周血液單核細胞中的表達水平與肝炎的嚴重程度相關(guān)［3～5］，提示hFgl 2可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及肝炎的活動。本研究旨在通過研究肝癌和不同嚴重程度慢性乙型肝炎患者肝組織內(nèi)hFgl 2蛋白的表達及其與轉(zhuǎn)氨酶等多項外周血液生化指標(biāo)的相關(guān)性，以探討肝組織內(nèi)hFgl 2蛋白的表達在肝癌及慢性乙型肝炎中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

采集2009～2011年在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病科、肝膽外科和南寧市第四人民醫(yī)院共57例住院患者的信息，其中慢性乙型肝炎患者35例，肝癌患者22例。將研究對象分為A組：輕度慢性乙型肝炎組14例；B組：中度慢性乙型肝炎組13例；C組：重度慢性乙型肝炎組8例；D組：肝癌組22例。慢性乙型肝炎的診斷及分度符合我國2000年修訂的《病毒性肝炎防治方案》［6］。肝癌診斷符合2001年中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會修訂的肝癌臨床診斷標(biāo)準。收集患者住院期間總膽紅素（TBIL）、轉(zhuǎn)氨酶（ALT、AST）、凝血酶原時間（PT）等生化檢測結(jié)果及相應(yīng)患者的肝組織或肝癌組織標(biāo)本，使用免疫組化方法檢測肝組織內(nèi)hFgl 2的表達，用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析軟件檢測hFgl 2的表達水平。

1.2 試劑

玉抗：鼠單克隆抗體（美國SANTA CRUZ公司）。Ⅱ抗：MaxVision鼠/兔-HRT即用型廣譜快捷免疫組化試劑盒（KIT-5020，福州邁新生物技術(shù)有限公司）。3-3二氨基聯(lián)苯胺（DAB-0031）、PBS磷酸鹽緩沖液、EDTA抗原修復(fù)液購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肝組織的免疫組化制片 將肝組織制成石蠟切片，切片脫蠟后用EDTA（pH=9.0）抗原修復(fù)液進行高壓抗原修復(fù)，自來水沖洗后置于30g/L過氧化氫溶液室溫孵育以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS沖洗后滴加稀釋的玉抗（濃度為1∶200的鼠單克隆抗體），室溫孵育1.5 h或置于冰箱冷藏室內(nèi)4℃過夜。PBS沖洗后加入50 μl生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育20～30 min。PBS沖洗除去多余二抗后進行DAB顯色，酒精脫水，封片。

1.3.2 MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析 以同一張切片內(nèi)hFgl 2凝血酶原酶表達陰性細胞為內(nèi)對照，觀察各組織免疫組化切片內(nèi)hFgl 2凝血酶原酶陽性的細胞種類及強度。采集hFgl 2凝血酶原酶陽性表達的肝組織細胞圖像，隨機選取8～10個區(qū)域，使用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析軟件測定其灰度值，取平均值為測定結(jié)果。灰度值與hFgl 2蛋白的表達水平呈負相關(guān)，即灰度值越低，hFgl 2蛋白的表達水平越高。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理實驗數(shù)據(jù)并分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（χ±s）表示。均數(shù)的比較采用拓展方差分析（Welch檢驗），兩兩比較采用Tamhan′s T2檢驗，雙變量相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組患者肝組織內(nèi)hFgl 2蛋白的表達情況

在所有慢性乙型肝炎患者肝組織和肝癌患者肝癌組織中均可見hFgl 2蛋白的表達。見圖1。

圖1 各組患者肝組織內(nèi)hFg1 2蛋白的免疫組化染色（×1 000）

2.2 各組患者PT、TBIL、ALT、AST的水平及肝內(nèi)hFgl 2蛋白表達平均灰度值的比較

各組患者PT、TBIL、ALT、AST的水平及hFgl 2的灰度值經(jīng)方差齊性檢驗提示方差不齊（P＜0.05），故使用拓展方差分析（Welch檢驗）行多組間均數(shù)比較，兩兩比較方法采用Tamhan′s T2檢驗。結(jié)果顯示重度慢性乙型肝炎組和肝癌組hFgl 2表達的平均灰度值低于輕度、中度慢性乙型肝炎組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組患者PT、TBIL、ALT、AST的水平及hFgl 2蛋白表達灰度值的比較（s）

表1 各組患者PT、TBIL、ALT、AST的水平及hFgl 2蛋白表達灰度值的比較（s）

☆與D組比較，P＜0.001；★分別與A組、B組、D組比較，P=0.003、0.012、0.004；△分別與D組比較，P=0.012、0.013。*分別與A組、B組比較，P=0.013、0.046；**分別與A組、B組比較，P=0.006、0.017。

項目 A組 B組 C組 D組 F′ P PT（s） 11.0±0.75☆11.7±1.23 11.6±1.12 13.4±2.00 6.331 0.003 TBIL（μmol/L） 13.6±5.7 28.30±23.8 76.7±30.0★17.5±8.3 12.357 ＜0.001 ALT（U/L） 32.7±13.3△106.0±108.0 222.7±204.3 140.±143.5 7.662 0.002 AST（U/L） 26.07±5.6△65.4±49.2 197.8±243.8 95.9±131.5 7.519 0.002 hFgl 2 182.0±1.31 181.8±2.64 178.7±2.08*177.0±6.05**8.82 ＜0.001

2.3 肝組織內(nèi)hFgl 2表達的灰度值與患者PT、ALT、AST、TBIL及患者年齡的關(guān)系

慢性乙型肝炎組（A組、B組、C組3組合并）hFgl 2蛋白表達的灰度值與患者ALT、AST的水平呈負相關(guān)（與ALT的相關(guān)系數(shù)rs=-0.561，P＜0.001；與AST的相關(guān)系數(shù)rs=-0.549，P=0.001），與患者年齡、PT、TBIL的水平無相關(guān)。肝癌組hFgl 2蛋白的表達與患者年齡、PT、ALT、AST、TBIL的水平均無相關(guān)性（P均＞0.05）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，重度慢性乙型肝炎組hFgl 2表達的平均灰度值低于輕度、中度慢性乙型肝炎組，慢性乙型肝炎組hFgl 2蛋白表達的灰度值與ALT、AST呈負相關(guān)，因其灰度值與hFgl 2蛋白的表達呈負向關(guān)系，表明重度慢性乙型肝炎患者肝組織內(nèi)hFgl 2的水平比輕度、中度慢性乙型肝炎患者高，且肝組織內(nèi)hFgl 2水平與轉(zhuǎn)氨酶水平呈正相關(guān)，說明hFgl 2的表達水平越高，肝炎程度越嚴重，肝細胞破壞程度越嚴重，提示hFgl 2可能在慢性乙型肝炎中發(fā)揮著加重肝損傷的作用。朱帆等［7］在重型肝炎患者肝組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)hFgl 2的表達，且其水平與血清膽紅素呈正相關(guān)。陳悅等［8］在重型乙型肝炎肝組織內(nèi)hFgl 2高表達細胞鄰近組織發(fā)現(xiàn)有纖維蛋白的沉積和微血栓的形成。hFgl 2是一種凝血因子，可直接激活凝血酶原，啟動凝血反應(yīng)［1］，陳悅等的研究結(jié)果說明hFgl 2可能是通過促凝血機制導(dǎo)致肝細胞破壞。本研究結(jié)果說明肝內(nèi)hFgl 2的表達水平越高，肝臟炎癥越嚴重，結(jié)合之前學(xué)者的研究，考慮hFgl 2肝損害機制可能是乙型肝炎病毒上調(diào)hFgl 2在肝內(nèi)的表達水平［9］，進而激活凝血反應(yīng)，導(dǎo)致局部微循環(huán)障礙，在病毒直接破壞和免疫損傷的基礎(chǔ)上，進一步加重肝細胞的損傷。不同于朱帆的研究，本研究hFgl 2的表達水平與轉(zhuǎn)氨酶水平呈正相關(guān)，而與膽紅素水平無相關(guān)性，考慮朱帆等研究病例為重型肝炎，肝細胞破壞殆盡，此時膽紅素水平才能真正反映肝炎嚴重程度，而在本研究中肝炎程度較輕，轉(zhuǎn)氨酶水平能較好反映肝細胞破壞的嚴重程度。

本研究還發(fā)現(xiàn)在肝癌組織內(nèi)hFgl 2呈高表達，其水平比慢性乙型肝炎輕度、中度組高，但不同于慢性乙型肝炎，肝癌組織內(nèi)hFgl 2的表達水平與血清轉(zhuǎn)氨酶等肝功能指標(biāo)無相關(guān)性，提示hFgl 2在肝癌中的作用可能與在慢性乙型肝炎中的作用不同。劉艷玲等［10］研究發(fā)現(xiàn)在體外hFgl 2蛋白可直接促進HCCLM 6腫瘤細胞的生長，且下調(diào)hFgl 2的表達能減緩裸鼠體內(nèi)HCCLM 6細胞的生長和新生血管形成［11］。hFgl 2在結(jié)腸癌、子宮頸癌、乳腺癌等多種腫瘤中高表達，且在高表達的細胞附近可見明顯的纖維蛋白沉積［2］，而已有研究顯示凝血酶能直接作用于腫瘤細胞，激活腫瘤細胞，促進新生血管的形成和腫瘤生長、轉(zhuǎn)移［12］，提示hFgl 2可能通過促凝血反應(yīng)，增加凝血酶的產(chǎn)生，進而激活腫瘤細胞，促進腫瘤的生長。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌組織內(nèi)存在hFgl 2的高表達，但不同于慢性乙型肝炎，在肝癌中hFgl 2的水平與血清轉(zhuǎn)氨酶等無相關(guān)，推測hFgl 2在肝癌中的作用與其在其他腫瘤中的作用類似，可能是通過促進凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，進而激活腫瘤細胞，促進腫瘤的生長，而不是通過引起微循環(huán)障礙導(dǎo)致肝細胞破壞。肝癌患者轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素的升高可能是由于腫瘤生長浸潤正常肝組織所致，故轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素的高低可能與hFgl 2無相關(guān)，而與腫瘤大小、浸潤程度有關(guān)。但因本研究病例數(shù)較少，今后可增加病例數(shù)及檢測癌周正常肝組織hFgl 2的表達以進一步明確。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)hFgl 2的表達水平與PT無關(guān)，提示hFgl 2的促凝機制可能只在局部發(fā)生作用，而對血液凝血功能無影響或者影響甚微，目前尚缺乏相關(guān)研究。此外，凝血功能與其他諸多因素有關(guān)，而肝臟能合成多種凝血因子，故肝臟功能與凝血功能密切相關(guān)。肝臟功能受損時，肝臟凝血因子合成減少，凝血功能障礙，PT延長，故PT是評估肝炎嚴重程度的重要指標(biāo)。本研究提示輕度慢性乙型肝炎的PT較肝癌組低，考慮所納入病例為肝穿刺活檢患者，這些患者一般均為凝血功能正常者，故PT水平不能代表總體慢性乙型肝炎患者的PT水平，且肝癌患者因肝功能受損，凝血因子合成可能會減少，故這些患者不一定如其他惡性腫瘤，呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，而出現(xiàn)PT延長［13］。有關(guān)方面有待進一步研究。

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［2014-10-10收稿］［2014-11-23修回］［編輯 阮萃才］

Hepatic expression of human fibroleukin in patients with liver cancer or hepatitis

MENG Meng-lan，YU Yan-hong，HUANG Li-yi，WU Ji-zhou（Department of Infectious Diseases，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

YU Yan-hong.E-mail：yuyanhong666@163.com

Objective To explore the expression of human fibroleukin（hFgl 2），also known as human fibrinogen-like protein 2 prothrombinase，in the livers of patients with liver cancer or chronic hepatitis B virus（HBV）infection，and to examine possible correlations of this expression with severity of HBV infection and serum biochemistry indicators.Methods Liver tissues were obtained from 35 patients with chronic HBV infection（14 mild，13 moderate，8 severe）and 21 patients with liver cancer.Expression of hFgl 2 was detected using immunohistochemistry，quantified using MIAS medical imaging software and compared among patients with liver cancer or the three severities of viral infection.Results Expression of hFgl 2 was significantly higher in patients with severe chronic HBV infection or liver cancer than in patients with mild or moderate infection.Among chronically infected patients，hFgl 2 expression positively correlated with serum ALT and AST；among patients with liver cancer，hFgl 2 did not correlate with serum ALT，AST，TBIL or PT.Conclusion The protein hFgl 2 is up-regulated in severe chronic HBV infection and in liver cancer.However，the expression level correlated with serum aminotransferase in chronically HBV-infected patients，but not in patients with liver cancer.This suggests that hFgl 2 may play different roles in liver cancer and chronic HBV infection.

Liver neoplasm；Human fibroleukin；Chronic hepatitis B virus infection；Liver tissue；Expression

R735.8

A

1674-5671（2014）04-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.04.12

廣西科學(xué)基金資助項目（桂科青0832038）

玉艷紅。E-mail：yuyanhong666@163.com