徐穎瑩，黃明亮，單梅，胡家金

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

當(dāng)年生喜樹種子的無菌發(fā)芽及幼苗生長

徐穎瑩，黃明亮，單梅，胡家金*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

以當(dāng)年生新鮮喜樹種子為材料，采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，研究其萌發(fā)及幼苗生長的適宜條件。結(jié)果表明，采用0.1% HgCl2和10% NaClO分別對(duì)外植體進(jìn)行消毒后，以0.1% HgCl2進(jìn)行果實(shí)消毒的種子萌發(fā)率最高，為41.11%；在此基礎(chǔ)上用10% NaClO將預(yù)培養(yǎng)種子浸泡3 min后，其萌發(fā)率和成苗率顯著提高，分別達(dá)85.56%和55.56%，而且幼苗生長狀態(tài)好，平均生成側(cè)根6~7條，主根長約10 cm；對(duì)未經(jīng)處理的種子苗做切根處理，并轉(zhuǎn)移到新鮮的MS培養(yǎng)基，幼苗生長效果與經(jīng)10% NaClO處理過的種子苗的生長效果相同，但將其轉(zhuǎn)移到含1 mg/L 6–BA的MS培養(yǎng)基后，種子苗的子葉變黃，無新根生成或只有1個(gè)短根生成。

喜樹；種子；萌發(fā)率；成苗率；切根

喜樹(Camptotheca acuminate Decne)是山茱萸目(Cornales)珙桐科(Nyssaceae)喜樹屬 (Camptotheae)多年生落葉喬木[1]，可作為園林觀賞及環(huán)境保護(hù)的綠化樹種[2–4]。喜樹是繼紅豆杉之后被發(fā)現(xiàn)的重要的木本抗癌藥用植物[5–6]。喜樹組織中含有的喜樹堿(camptothecin, CPT) 具有抗癌活性[7–8]，可以通過阻斷癌細(xì)胞中 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 I (topoisomerase, TopoI) 的合成來阻止癌細(xì)胞的形成[9]。目前對(duì)喜樹的研究多數(shù)是針對(duì)喜樹堿的分離、提取與鑒定[10]，喜樹愈傷的誘導(dǎo)[4,8]和莖段的扦插快繁[6,11]等。關(guān)于喜樹種子無菌發(fā)芽及幼苗生長的研究少見報(bào)道。喜樹的無菌扦插繁殖受季節(jié)影響，愈傷組織誘導(dǎo)再生植株的周期較長，無菌苗的大量獲得困難，故采用種子無菌發(fā)芽來解決該問題具有現(xiàn)實(shí)意義。鑒于喜樹種子本身的休眠作用，其萌發(fā)率不高[12]。筆者從種子無菌發(fā)芽角度來研究當(dāng)年生喜樹種子的適宜萌發(fā)條件及喜樹種子萌發(fā)率和成苗率的提高途徑，旨在建立良好的喜樹無菌苗培養(yǎng)體系。

1 材料和方法

1.1 材 料

當(dāng)年生新鮮喜樹果實(shí)采于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。試驗(yàn)時(shí)剝?nèi)」麑?shí)內(nèi)種子接種。

采用MS基本培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基均含3%的蔗糖和0.8%的瓊脂，pH 5.8，高壓滅菌。

1.2 方 法

1.2.1 種子和幼苗的培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基分裝于100 mL的三角瓶中，每瓶40 mL左右。接種時(shí)每個(gè)處理5瓶。每瓶接種6粒種子。重復(fù)3次。材料培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，光照度1 500~ 2 000 lx，光照時(shí)間16 h，相對(duì)濕度大于50%。

1.2.2 適宜外植體消毒方式的選取

將喜樹果實(shí)和種子分別用流水沖洗干凈，再用蒸餾水潤洗2遍；于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用70%的乙醇表面消毒約60 s，再用無菌水沖洗1遍，然后將果實(shí)和種子分別進(jìn)行消毒(T1：0.1% HgCl2果實(shí)消毒；T2：10% NaClO果實(shí)消毒；T3：0.1% HgCl2種子消毒；T4：10% NaClO種子消毒)。消毒時(shí)不時(shí)地?fù)u動(dòng)，10 min后倒去消毒液，并用無菌水反復(fù)沖洗3次以上。消毒后的種子直接接種于MS培養(yǎng)基上；果實(shí)則剝?nèi)ス夂蠼臃N于MS培養(yǎng)基中。觀察并統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率。

1.2.3 預(yù)培養(yǎng)喜樹種子的不同化學(xué)溶液處理

將喜樹種子按 1.2.2中篩選出的適宜外植體消毒方式進(jìn)行處理后預(yù)培養(yǎng) 15 d，再分別用 10% NaClO、1% NaClO和70%乙醇處理3 min，接種在新鮮的MS培養(yǎng)基上，各處理均接種30粒種子。以未經(jīng)化學(xué)溶液處理的種子為對(duì)照。統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率和成苗率，并觀察幼苗生長狀態(tài)。

1.2.4 種子苗的切根處理及轉(zhuǎn)移

將未經(jīng)化學(xué)溶液處理的種子苗切去部分根部(留下與莖部相接的一小部分)，并轉(zhuǎn)移到分別附加了0、1 mg/L 6–BA的MS培養(yǎng)基上，觀察切根處理后幼苗在不同培養(yǎng)基上的生長情況。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 喜樹種子的萌發(fā)情況

2.1.1 不同外植體消毒方式下喜樹種子的萌發(fā)率

表1結(jié)果表明，T1、T2處理喜樹種子的萌發(fā)率較高，而T3、T4處理喜樹種子的萌發(fā)率很低，且前者與后者之間的差異均達(dá)顯著水平。考慮到用10% NaClO消毒的污染率較高，因此，采用T1處理(0.1% HgCl2果實(shí)消毒)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 各消毒處理喜樹種子的萌發(fā)情況Table 1 Effects of different treatments on seed germination of Camptotheca acuminate

2.1.2 化學(xué)溶液處理對(duì)喜樹種子萌發(fā)的影響

表2結(jié)果表明：3種化學(xué)溶液處理都使喜樹種子的萌發(fā)率得到了提高，其中以1% NaClO處理的效果最好，10% NaClO處理的效果次之，且均與對(duì)照差異顯著，而70%乙醇處理與對(duì)照間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于1% NaClO處理的成苗率不高，所以，在后續(xù)試驗(yàn)中采用10% NaClO處理。

表2 不同化學(xué)溶液處理喜樹種子的萌發(fā)率和成苗率Table 2 Effects of different chemical solution treatments on the rate of seed germination and seedling of Camptotheca acuminate

2.2 不同處理喜樹幼苗的生長情況

2.2.1 化學(xué)溶液處理后喜樹種子的成苗率和幼苗生長情況

由表2可見，經(jīng)過3種化學(xué)溶液處理后，種子的成苗率以 10% NaClO處理的最高(顯著高于對(duì)照)，70%乙醇處理的最低(顯著低于對(duì)照)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照(未經(jīng)任何處理)的幼苗無真葉長出，只有1條粗而短的主根，無側(cè)根形成 (圖1–a)；經(jīng)10% NaClO處理的幼苗生長較快，在相同的時(shí)間內(nèi)可以較快地長出真葉，葉色深綠(圖1–b)，幼苗主根長達(dá)10 cm，在主根上生有6~7條長短不一的側(cè)根，具有發(fā)達(dá)的根系(圖 1–c)?？梢?，采用10% NaClO處理過的喜樹種子生成的幼苗，其生長狀態(tài)優(yōu)于對(duì)照幼苗。

圖1 對(duì)照和10% NaClO處理的喜樹幼苗及其根系Fig. 1 Seedlings and roots under treatment of contrast and 10% NaClO

2.2.2 幼苗切根轉(zhuǎn)移對(duì)其生長的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，種子萌發(fā)后在原培養(yǎng)基上生長緩慢，甚至生長停滯，這可能是由于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分在種子萌發(fā)過程中被消耗殆盡，或者是種子萌發(fā)后在幼苗的周圍形成了某種抑制生長的物質(zhì)。

未經(jīng) 10%NaClO處理的種子苗，切除其部分主根，并轉(zhuǎn)移到新鮮MS培養(yǎng)基后，幼苗生長快，葉色青綠，植株健壯，而且根部形成較多的側(cè)根，平均為7~8條，根長約9 cm (圖2)，而轉(zhuǎn)移到含有1 mg/L 6–BA的MS培養(yǎng)基中的幼苗長勢較弱，葉色發(fā)黃，也無側(cè)根生成(圖3)。

圖2 切根后轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上生長1個(gè)月的幼苗及其根部Fig.2 Seedlings and roots growing in a month in MS medium after root-cut

圖3 切根并轉(zhuǎn)移到含1 mg/L 6–BA的MS培養(yǎng)基上生長1個(gè)月的幼苗及其根部Fig.3 Seedlings and roots growing in a month after root-cut and transferred to MS medium with 1 mg/L 6–BA

3 結(jié)論與討論

a. 成熟的喜樹種子具有較長的休眠期，采用適當(dāng)?shù)奈锢矸椒ɑ蚧瘜W(xué)方法可有效地打破種子休眠。剪破種皮可以打破喜樹種子的休眠[13]。本研究結(jié)果表明，喜樹果實(shí)消毒后去除果皮時(shí)，種子受到的機(jī)械劃傷、種皮被割破等使種皮透氣、透水，從而促進(jìn)了種子的萌發(fā)。

b. 適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法浸泡種子可以軟化種皮，去除一些種皮內(nèi)的抑制物，促進(jìn)種子萌發(fā)[15–16]。蘭花碧玉春和獨(dú)占春雜交種子無菌萌發(fā)試驗(yàn)，采用10% NaClO溶液浸泡種子10 min，提高了種子的萌發(fā)率[16]。王菲等[17]采用25% NaClO溶液浸泡樹莓種子也得到了較高的種子發(fā)芽率。呂春華等[18]采用0.4% NaClO溶液浸泡青楓種子，其萌發(fā)率最高達(dá)到了67%。本研究中在0.1% HgCl2果實(shí)消毒的基礎(chǔ)上采用10% NaClO溶液處理種子3 min，有效提高了喜樹種子的萌發(fā)率，而且后期的成苗率也顯著提高，長成的幼苗健壯，葉色濃綠，根系發(fā)達(dá)。

c.切斷主根可以抑制主根的生長，促進(jìn)側(cè)根的發(fā)生[19–20]。其原因可能是切除部分主根后，苗木地上部分的水分供應(yīng)減少，苗木的生長受到限制，從而根部被迫生長出更多的側(cè)根和毛細(xì)根，以吸收水分供給苗木[21]。本研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)未經(jīng)處理的種子苗做切根處理，并轉(zhuǎn)移到新鮮的 MS培養(yǎng)基上后，幼苗生長可以達(dá)到與經(jīng)10% NaClO處理過的種子苗相同的效果，其幼苗的根系發(fā)達(dá)，幼苗健壯，但培養(yǎng)基中含1 mg/L 6–BA時(shí)抑制了幼苗側(cè)根的生成。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Aseptic germination and seedling growth of Camptotheca acuminate seeds on that very year

XU Ying-ying，HUANG Ming-liang，SHAN Mei，HU Jia-jin*
(College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

The suitable condition of seeds germination and their growth were researched by taken fresh seeds of Camptotheca acuminate on that very year as materials through plant tissue culture. To compare the rate of seed germination, explants were disinfected with 0.1% HgCl2and 10% NaClO respectively. The result showed that rate of seed germination was the highest with 0.1% HgCl2disinfection, which achieved 41.11%. Further, rate of seed germination and seedling were significantly increased with 10% NaClO soak for 3 minutes on the basis of treatment of 0.1% HgCl2disinfection, which reached 85.56% and 55.56% respectively. Fresh seedlings grew well with an average of 6–7 lateral roots and a 10 cm long taproot. The growth of seedlings treated by root-cut and transferred in fresh MS medium were same as treatment with 10% NaClO. Seedlings, however, became yellow and had no new root or only one short root after transferred them to MS medium with 1 mg/L 6–BA .

Camptotheca acuminate; seeds; germination rate; seedling rate; root-cut

Q945.34

A

1007?1032(2014)03?0277?04

10.13331/j.cnki.jhau.2014.03.011

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2013–12–29

湖南省教育廳項(xiàng)目(08C430)

徐穎瑩(1988—)，女，河南平頂山人，碩士研究生，主要從事植物生物技術(shù)研究，gxqdjs@126.com；*通信作者，jjhu3@ sohu.com