楊利民，呂金萍，馮妍

（常州大學(xué)石油化工學(xué)院，江蘇 常州 213164）

蒲公英總黃酮在聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系中的分配與提取

楊利民，呂金萍，馮妍

（常州大學(xué)石油化工學(xué)院，江蘇 常州 213164）

蒲公英中內(nèi)含的黃酮類物質(zhì)具有較高藥用價(jià)值，用雙水相萃取法提取植物中有效成分是新型提取高附加值生物質(zhì)的有效方法。本文考察了PEG/(NH4)2SO4雙水相體系萃取分離蒲公英總黃酮時(shí)聚乙二醇相對(duì)分子質(zhì)量、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、溫度、pH值5個(gè)因素對(duì)分配行為的影響，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了工藝條件。結(jié)果表明最佳雙水相提取工藝條件為:(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%，PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)23%，pH值5.34，提取溫度25℃，NaCl鹽的存在與否對(duì)萃取影響很小，蒲公英中總黃酮的提取率可達(dá)5.47%。因此，使用雙水相法提取蒲公英總黃酮是該類提取技術(shù)中一種更加綠色環(huán)保和高效的方法。

蒲公英；總黃酮；雙水相；分配；提取

蒲公英又名黃花地丁，屬菊科多年生植物，是一種重要的中草藥，主要成分為黃酮類物質(zhì)，藥用價(jià)值高。據(jù)報(bào)道黃酮類物質(zhì)有很多的生物活性[1-3]，具有清熱解毒、消癰散結(jié)、利尿、緩瀉、退黃疸、利膽等功效[4]。

兩種高聚物或高聚物與某種高價(jià)無(wú)機(jī)鹽溶于水并靜止一段時(shí)間后會(huì)形成不相容的上下兩相，其中兩相都含有大量的水分，這一兩相體系稱作雙水相體系。這種現(xiàn)象由Beijerinck于1896年第一次發(fā)現(xiàn)，因兩相對(duì)某些化學(xué)物質(zhì)的溶解性的差異，雙水相體系被廣泛用作一種較為新型的萃取方法-雙水相萃取，如雙水相萃取被廣泛用于生物化學(xué)和生物化工產(chǎn)品的分離純化[5-6]。與傳統(tǒng)的方法相比，雙水相萃取技術(shù)具有操作條件溫和、易于工業(yè)放大、成本低、過(guò)程連續(xù)化等優(yōu)點(diǎn)。目前在中藥提取領(lǐng)域，雙水相萃取已經(jīng)有效應(yīng)用于黃芩苷[7]、葛根素[8]、黃酮類化合物[9-12]、綠原酸[13]等天然中藥化合物的提取，但聚乙二醇（PEG）/(NH4)2SO4雙水相體系在蒲公英總黃酮萃取中的應(yīng)用還尚未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。本文主要研究了蒲公英總黃酮在PEG/(NH4)2SO4雙水相體系中的分配行為，檢測(cè)了PEG/(NH4)2SO4雙水相體系的相圖，考察了雙水相組成、溫度、pH值等因素對(duì)蒲公英總黃酮提取率的影響，從而可以優(yōu)化雙水相萃取蒲公英總黃酮的工藝條件。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

蒲公英全草（采于常州大學(xué)）用清水洗干凈，于65℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥烘干12h，粉粹后過(guò)80目篩子；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PEG，平均相對(duì)分子質(zhì)量分別為400、1000、4000；95%乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉，均為市售分析純。

721G可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；WT2102型分析天平，常州萬(wàn)得天平儀器有限公司；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；KQ-3200B超聲波清洗器，鞏義市于華儀器有限責(zé)任公司；PHS-3C pH計(jì)，上海盛磁儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取一定量的蒲公英樣品粉末，用石油醚浸泡1h，脫脂。然后倒出，揮發(fā)至干。加入一定量的60%乙醇微波加熱，離心分離得粗提液。

以乙醇粗取液為原料，固定雙水相體系總質(zhì)量10g，在10mL的離心管中加入一定量的PEG和(NH4)2SO4，2mL粗提液，加水至10g，搖勻后2000r/min離心5min，靜置分層。分別測(cè)定兩相中總黃酮的含量。按照式（2）、式（3）計(jì)算黃酮在雙水相體系中的分配系數(shù)K和萃取率Y。

式中，R為雙水相體系上下相的體積比； Vt為雙水相體系上相體積，mL；Vb為雙水相體系下相體積，mL；K為雙水相體系分配系數(shù)；Ct為雙水相體系中上相黃酮的濃度，mg/mL；Cb為雙水相體系中下相黃酮的濃度，mg/mL；Y為蒲公英黃酮在雙水相中的萃取率，%。

1.3 蒲公英中總黃酮含量的測(cè)定

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系分光光度法測(cè)定總黃酮含量[14]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，溶液在400～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)全波長(zhǎng)掃描，在波長(zhǎng)507～510nm出現(xiàn)最大值，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，選擇用510nm波長(zhǎng)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線和蒲公英總黃酮的含量。黃酮類化合物濃度C與吸光度A的線性回歸方程式為：y=11.59714x-0.0031，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮含量。蒲公英中總黃酮的提取率如式（4）。

式中，m為提取液中總黃酮的質(zhì)量，g；M為加入的蒲公英樣品粉末的總質(zhì)量，g。

1.4 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖的制作

25℃下，根據(jù)Albertsson濁點(diǎn)法[15]，分別測(cè)定并制作由PEG400、PEGl000、PEG4000與(NH4)2SO4溶液形成的各體系相圖。

準(zhǔn)確稱取2.0g 40%PEG400溶液于燒杯中，加入已知濃度的(NH4)2SO4溶液，振蕩，滴至混合物體系剛好出現(xiàn)渾濁狀態(tài)，記錄加入的質(zhì)量（g），然后加水至溶液澄清，記錄加入水的質(zhì)量（g）。算出此時(shí)PEG和(NH4)2SO4在系統(tǒng)中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即得相圖中的一個(gè)點(diǎn)。重復(fù)上述操，以硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)作圖，即可得PEG/硫酸銨體系相圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系相圖

測(cè)得的雙水相相圖如圖1所示，曲線上的點(diǎn)為臨界點(diǎn)，曲線下方為單相區(qū)，不分相；上方為兩相區(qū)。

在兩相區(qū)內(nèi)，上相富含PEG，下相富含(NH4)2SO4，在(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，PEG相對(duì)分子質(zhì)量越大，成相時(shí)所需的PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越小，越易形成雙水相體系。但是PEG分子量越大，黏度越大，分相時(shí)間越長(zhǎng)。當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)低不能形成兩相；過(guò)高會(huì)析出。因此，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)應(yīng)從曲線上方的區(qū)域選取，但PEG相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)三者需相互協(xié)調(diào)。

圖1 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖

2.2 雙水相萃取的影響因素

2.2.1 PEG相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)萃取的影響

根據(jù)相圖，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為20%的不同相對(duì)分子質(zhì)量的PEG（400、1000、4000）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的(NH4)2SO4分別組成雙水相體系，研究蒲公英中總黃酮的分配系數(shù)K和萃取率Y的變化，結(jié)果見(jiàn)表1。表1中，隨著PEG相對(duì)分子質(zhì)量的增加，上下相體積比R逐漸減小，下相體積逐漸增大。分配系數(shù)K在PEG相對(duì)分子質(zhì)量為400時(shí)較小，1000和4000時(shí)，相差不大。PEG相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)萃取率Y影響不明顯。這與文獻(xiàn)[10，16]結(jié)論一致。因?yàn)镻EG相對(duì)分子質(zhì)量越低，親水性越好，成相時(shí)水分分配得越多，上下相體積比越大。隨著PEG相對(duì)分子質(zhì)量增加，雖然上相體積減少，但總黃酮濃度增加，分配系數(shù)增大，有利于后續(xù)總黃酮與上相的分離。綜合來(lái)看，PEG1000萃取效果最好，所以后續(xù)試驗(yàn)都采用PEG1000進(jìn)行相關(guān)研究。

2.2.2 PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相體系的影響

考察了PEG1000和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)上下相體積、分配系數(shù)和萃取率影響。用3組不同的(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)在改變PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的條件下，進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時(shí)的萃取效果最好。依此為例加以說(shuō)明（表2）。當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于18%時(shí)，體系不能形成兩相；PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于26%時(shí)，會(huì)有鹽析出。隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，兩相的體積比R逐漸增大，下相體積逐漸減小。這與文獻(xiàn)[12]結(jié)論一致。因?yàn)镻EG質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，奪取鹽相中水分子的能力增強(qiáng)，上相體積增加，上相中PEG的濃度依然是增加的，這有利于蒲公英總黃酮更多分配到上相中，因此分配系數(shù)和萃取率都增大?？紤]成本，選擇PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%。

2.2.3 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相體系的影響

固定PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)在24%，考察(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蒲公英總黃酮的分配系數(shù)和萃取率的影響（表3）?？梢钥闯觯S著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，兩相體積比逐漸減小，下相體積逐漸增大。這與文獻(xiàn)[17-18]結(jié)論一致。因?yàn)榱蛩徜@是強(qiáng)電解質(zhì)，在水中離解為正、負(fù)離子，形成水合離子的能力增強(qiáng)，能奪取更多的水分子，所以下相體積增加，上下相體積比下降。表3中，隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，分配系數(shù)和萃取率先增加，到(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時(shí)達(dá)到最大，而后下降。原因是隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，上相中PEG含量和(NH4)2SO4都增加，上相中PEG含量增加有利于被萃取物的提取[19]，但(NH4)2SO4含量增加不利于這種提取。所以在(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時(shí)，分配系數(shù)和萃取率都達(dá)到各自的最大值。

2.2.4 pH值的影響

pH值不同，雙水相體系中兩相的電位差不同[19]，不僅影響上下兩相的體積比，也影響各種待分離成分在上下相的分配。在選擇PEG1000和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為24%和18%的雙水相體系，采用HCl和NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH值，考察pH值對(duì)總黃酮在雙水相體系中分配系數(shù)和萃取率的影響，結(jié)果如圖2。由于(NH4)2SO4為強(qiáng)酸弱堿鹽，顯微酸性，堿性條件下易水解，釋放出氨氣，從而影響雙水相體系的穩(wěn)定，所以選擇pH值在1～7范圍內(nèi)來(lái)考察體系pH值對(duì)蒲公英中總黃酮分配系數(shù)和萃取率的影響。從圖2可以看出，隨著體系pH值的增大，分配系數(shù)K和萃取率Y都是先增大后減小，pH值為3.74時(shí)，這一雙水相體系的分配系數(shù)和萃取率較高。

表1 PEG相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)蒲公英總黃酮分配的影響

表2 PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蒲公英總黃酮分配的影響

2.2.5 溫度的影響

溫度對(duì)雙水相體系的熱力學(xué)平衡有顯著的影響[20]，從而間接影響了蒲公英總黃酮在兩相中的分配。PEG1000和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為24%和18%且pH值在3.74的條件下，考察溫度對(duì)雙水相體系的影響，見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著溫度的升高，雖然分相速度加快，但由于溶解度增加，上下相體積比R和萃取率都逐漸降低。大規(guī)模的雙水相萃取操作一般在室溫下進(jìn)行，不僅能節(jié)省能源也能提高收率。

2.2.6 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

在25℃、PEG1000和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為24%和18%、pH值為3.74的條件下，考察加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl鹽對(duì)雙水相體系萃取蒲公英中總黃酮的影響，見(jiàn)表4。

在雙水相體系中加入NaCl，由于正、負(fù)離子在兩相間的分配系數(shù)不同，在兩相間形成電位差，從而影響帶電大分子的分配。由表4可見(jiàn)，加入NaCl，兩相體積比R、分配系數(shù)K和萃取率Y有小幅下降；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.3%時(shí)鹽不能完全溶解，或造成(NH4)2SO4析出。從成本和后續(xù)分離考慮，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中可以不加入NaCl。

表3 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蒲公英總黃酮分配的影響

圖2 pH值對(duì)分配系數(shù)和萃取率的影響

圖3 溫度對(duì)分配系數(shù)和萃取率的影響

表4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蒲公英總黃酮分配的影響

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、pH值（C）3個(gè)因素3個(gè)水平[L9(34)]進(jìn)行正交試驗(yàn)（表5）。

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，從試驗(yàn)結(jié)果看出，各因素對(duì)蒲公英黃酮分配的影響順序?yàn)?NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞pH值＞PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)，最優(yōu)的條件是PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)23%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%、pH值5.34，分配系數(shù)達(dá)到最大88.32。與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

表5 L9(34)正交試驗(yàn)水平和因素設(shè)計(jì)

2.4 不同方法的比較結(jié)果

取上述正交試驗(yàn)最優(yōu)條件下的雙水相體系30g，加入0.50g蒲公英粉末，在微波條件下考察蒲公英總黃酮的提取率。采用微波輔助主要是為縮短雙水相直接采取的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與乙醇水浴加熱回流法、微波輔助萃取法、超聲波輔助萃取法等3種方法進(jìn)行了比較，見(jiàn)表7。3種方法中的實(shí)驗(yàn)條件分別如下：乙醇水浴加熱回流法，60%乙醇、料液比1∶60、加熱1h；微波輔助萃取法，乙醇濃度60%、料液比1∶60、微波功率350W、微波時(shí)間55s；超聲波輔助萃取法，乙醇濃度60%、料液比1∶60、超聲時(shí)間30min。

與乙醇水浴加熱回流法相比，微波輔助時(shí)最優(yōu)條件下的雙水相體系的蒲公英總黃酮提取率提高了15.36%；與微波法和超聲法相比，分別提高了4.02%和7.68%。乙醇水浴加熱回流法因長(zhǎng)時(shí)間且高溫的加熱使得黃酮類物質(zhì)分解，不利于總黃酮的提取。微波輔助和超聲萃取法，縮短了萃取時(shí)間，也一定程度上提高了總黃酮的提取率。而雙水相體系的提取率是最高的，而且溶劑無(wú)毒、用量減少，節(jié)省了成本。另外，極性強(qiáng)的親水性物質(zhì)更多的進(jìn)入富含硫酸銨的下相，使得上相蒲公英總黃酮的純度進(jìn)一步提高。

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表7 雙水相萃取法與其它方法的比較

3 結(jié) 論

考察了蒲公英黃酮在PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系中的分配規(guī)律，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化，最佳萃取雙水相體系的PEG相對(duì)分子質(zhì)量是1000，PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23%，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，萃取溫度在25℃、體系pH值為5.34。用這種雙水相體系，在微波輔助下直接萃取蒲公英中的總黃酮，提取率可達(dá)5.47%。與其他傳統(tǒng)方法相比，雙水相萃取法的提取率有了明顯的提高。所以，雙水相法萃取蒲公英總黃酮是一種更加綠色環(huán)保、又易于工業(yè)化的高效方法。

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Partition and extraction of total flavonoids from Taraxacum mongolicum in PEG/(NH4)2SO4aqueous two-phase system

YANG Limin，Lü Jinping，F(xiàn)ENG Yan
（School of Petrochemical Technology，Changzhou University，Changzhou 213164，Jiangsu，China）

Total flavonoids inTaraxacum mongolicumare a highly effective medicine，and aqueous two-phase extraction process is an effective technique for extracting biomaterials from plant. Effect of molecular weight and mass fraction of PEG，mass fraction of (NH4)2SO4，temperature and pH of aqueous two-phase system were investigated during extraction of total flavonoids fromTaraxacum mongolicum.The optimal extraction conditions were obtained through orthogonal experiments. The optimal condition thus obtained is as follows:the average molecular weight of PEG at 1000，the mass fraction of PEG1000 at 23%，the mass fraction of (NH4)2SO4at 18%，temperature at 25℃，pH at 5.34. The NaCl addition has little effect on flavonoids partition. The extraction yield of total flavonoids fromTaraxacum mongolicumcan reach up to 5.47% under this optimal condition. Compared with other extraction methods，the aqueous two-phase extraction process is a more environment-friendly and highly efficient technique.

Taraxacum mongolicum；total flavonoids；aqueous two-phase system；partition；extraction

TQ 028.8

A

1000-6613（2014）08-1992-06

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.08.009

2013-12-18；修改稿日期：2014-01-16。

及聯(lián)系人：楊利民（1962—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槎嘞喾磻?yīng)與分離。E-mail lyang@jpu.edu.cn。