韓瑨，吳正鈞，季紅，高彩霞，游春蘋(píng)

（乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司，上海200436）

腸膜明串株菌Leuco 4的篩選、鑒定及產(chǎn)糖條件的優(yōu)化

韓瑨，吳正鈞，季紅，高彩霞，游春蘋(píng)

（乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司，上海200436）

以M17蔗糖培養(yǎng)基為篩選模型，從云南泡菜中篩選得到一株高產(chǎn)多糖的菌株Leuco 4，經(jīng)鑒定為腸膜明串珠菌（CGMCCNO.6432）。對(duì)該菌株進(jìn)行產(chǎn)糖條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)：在脫脂乳濃度10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、蔗糖濃度5%（w/v）、接種量2%（v/w）、發(fā)酵溫度28℃的條件下，180r/min搖床培養(yǎng)80h后發(fā)酵液中多糖含量可達(dá)到11g/L以上。

腸膜明串珠菌Leuco 4；脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基；產(chǎn)糖條件優(yōu)化

微生物胞外多糖是指某些特定微生物（如乳酸菌[1-2]、土壤桿菌[3]、根瘤菌[4-5]等）在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞壁外的一類(lèi)糖類(lèi)化合物，其中，依附于微生物細(xì)胞壁外的多糖被稱(chēng)為莢膜多糖，而黏液多糖則以滲透于生長(zhǎng)環(huán)境中的形式存在。微生物胞外多糖不但可以賦予發(fā)酵乳制品特殊的風(fēng)味[6]，還具有一定的降血壓[7]、降血脂、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等保健功能[8-9]。隨著生活質(zhì)量的不斷提高，食品添加劑（如增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑等）的安全問(wèn)題越來(lái)越受到消費(fèi)者的重視，因此，尋找來(lái)源明確、產(chǎn)量穩(wěn)定、功能多樣的新型食品添加劑越來(lái)越受到研究者的重視。

明串珠菌（Leuconostoc）是一類(lèi)乳品生產(chǎn)中重要的商業(yè)化菌株，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌。前期的研究表明，明串珠菌具有調(diào)節(jié)腸道紊亂[10]、代謝果糖生成甘露醇[11]、合成K族維生素[12]、水解α-半乳糖苷[13]、產(chǎn)細(xì)菌素[14]等益生功能，同時(shí)有助于形成干酪孔眼[15]、產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)[16]。更重要的是，明串珠菌可在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，利用蔗糖為底物合成右旋葡聚糖（dextran，多糖的一種）[17]，具有增黏、穩(wěn)定、乳化水體系以及持水性等特性[18]，可作為天然來(lái)源的穩(wěn)定劑或增稠劑來(lái)替代現(xiàn)有的合成添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)，因此，明串珠菌及其產(chǎn)糖特性已受到廣泛的重視。

本文報(bào)道了腸膜明串株菌Leuco 4的篩選、鑒定與產(chǎn)糖條件優(yōu)化的過(guò)程，并比較了該菌株在脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基和化學(xué)合成培養(yǎng)基中的產(chǎn)糖能力，旨在為明串珠菌的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料：云南泡菜，M17瓊脂/液體培養(yǎng)基（OXOID LTD.，英國(guó)），脫脂乳粉（Foterra，新西蘭），蔗糖，蛋白胨，酵母抽提物，K2HPO4，MgSO4·7H20，MnSO4，NaCl，CaCl2，F(xiàn)eSO4，三氯乙酸（上述材料均來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海）。

1.2 主要儀器設(shè)備

108H型電爐：Fisherscientific；HVE-50型高壓滅菌鍋：HIRAYAMA公司；SG-402TX型超凈工作臺(tái)：THE BAKERCOMPANY公司；XW-80A型漩渦混合儀：上海青浦滬西儀器廠；AVANTIJ30I型高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)BECKMANCOULTER公司；FreeZone 12型真空冷凍干燥機(jī)；美國(guó)LABCONCO公司；DK-8D型電熱恒溫水槽、GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-25型pH計(jì)：美國(guó)奧立龍公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的篩選、保藏與鑒定

選取云南泡菜1 g放入50 mL無(wú)菌蒸餾水中，振搖2 min后，依次用無(wú)菌蒸餾水以10倍稀釋法逐管稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5系列濃度，通過(guò)涂布的方式將稀釋液均勻涂布于無(wú)菌的M17蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上，28℃好氧培養(yǎng)48 h后選取拉絲性好，菌落光滑有明顯突起的菌落反復(fù)接種于M17蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)以達(dá)到純化的目的。用接種環(huán)挑取純化后的單菌落重懸于10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）脫脂乳中，經(jīng)冷凍干燥后－80℃保藏。

采用生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)合16S rDNA基因序列比對(duì)的方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.2 發(fā)酵種子的制備

將腸膜明串珠菌Leuco 4的凍干粉以少量無(wú)菌蒸餾水溶解，用接種環(huán)挑取一環(huán)劃線于M17蔗糖瓊脂培養(yǎng)[以5%（w/v）蔗糖取代M17培養(yǎng)基中0.5%（w/v）的乳糖，在120℃下滅菌20 min即得]上，28℃好氧培養(yǎng)24 h取出，用接種環(huán)挑取單菌落接入1 mL M17蔗糖液體培養(yǎng)基中，采用渦旋混合儀將細(xì)胞均勻分散后，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h取出，再以2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于50 mL上述M17蔗糖液體培養(yǎng)基中，再次于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)物15000r/min離心10 min，棄去上清，沉淀部分以無(wú)菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養(yǎng)體積的無(wú)菌蒸餾水懸浮，得到發(fā)酵用的種子。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基的制備：將6.0%～12.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）脫脂乳粉與2.5%～10.0%（w/v）蔗糖按一定配比與蒸餾水混勻，充分溶解后，在120℃下滅菌20 min即得所需濃度的無(wú)菌脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基。

化學(xué)合成培養(yǎng)基的制備：將蛋白胨10 g、酵母抽提物5 g、蔗糖50 g、K2HPO420 g、MgSO4·7H20 0.2 g、MnSO40.01 g、NaCl 0.01 g、CaCl20.02 g、FeSO40.01 g與1 L蒸餾水混勻，充分溶解后，在120℃下滅菌20 min即得所需的無(wú)菌化學(xué)合成培養(yǎng)基。

1.3.4 多糖的制備

將發(fā)酵液在沸水浴30 min，冷卻至室溫后加入三氯乙酸，使其終濃度達(dá)到2%～4%（體積分?jǐn)?shù)），16 h靜置，15 000 r/min離心10 min，取上清，加入3倍（體積分?jǐn)?shù)）的80%～100%乙醇于上述離心后的上清液中，靜置過(guò)夜，15 000 r/min離心10 min，收集沉淀物并溶于蒸餾水，用截留量為10000U的透析袋在蒸餾水中透析48h，每8小時(shí)換水1次，袋內(nèi)透析液經(jīng)真空冷凍干燥即可。

1.3.5 產(chǎn)糖條件的優(yōu)化

1.3.5.1 不同接種量對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響

分別將腸膜明串珠菌Leuco4種子液按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接入脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含脫脂乳10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、蔗糖5%（w/v），28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，并于不同的培養(yǎng)時(shí)間，取發(fā)酵液按1.3.4所述方法制備多糖并稱(chēng)重。

1.3.5.2 不同脫脂乳濃度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響

分別將腸膜明串珠菌Leuco 4種子液以2%的接種量接入脫脂乳含量為6%、8%、10%、12%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），蔗糖含量為5%（w/v）的脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，發(fā)酵終點(diǎn)處的發(fā)酵液按1.3.4所述方法制備多糖并稱(chēng)重。

1.3.5.3 不同蔗糖濃度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響

分別將腸膜明串珠菌Leuco 4種子液以2%的接種量接入脫脂乳含量為10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），蔗糖含量為2.5%、5.0%、7.5%、10%（w/v）的脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，發(fā)酵終點(diǎn)處的發(fā)酵液按1.3.4所述方法制備多糖并稱(chēng)重。

1.3.5.4 不同發(fā)酵溫度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響

將腸膜明串珠菌Leuco 4種子液以2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接入脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中，該脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中含脫脂乳10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），蔗糖5%（w/v），分別置于25、28、31、34℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床培養(yǎng)48 h，發(fā)酵終點(diǎn)處的發(fā)酵液按1.3.4所述方法制備多糖并稱(chēng)重。

1.3.5.5 腸膜明串珠菌Leuco 4在脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基和純化學(xué)培養(yǎng)基中的產(chǎn)糖能力比較

將腸膜明串珠菌Leuco 4種子液以2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接入脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基和化學(xué)合成培養(yǎng)基中，該脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中含脫脂乳10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），蔗糖5%（w/v），28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)120 h，取不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液按按1.3.4所述方法制備多糖并稱(chēng)重。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的篩選與鑒定

純化后獲得的菌株Leuco 4在M17蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上呈乳黃色、黏性的菌落，見(jiàn)圖1。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 腸膜明串珠菌Leuco 4在M17蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Morphologic characteristic of Leuconostoc mesenteroides Leuco 4 growth on M17-sucrose media

表1 腸膜明串珠菌Leuco 4的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics ofLeuconostoc mesenteroides Leuco 4

該結(jié)果結(jié)合其16S rDNA序列（未列出）顯示Leuco 4為一株腸膜明串珠菌，現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC），編號(hào)為CGMCC NO.6432。

2.2 產(chǎn)糖條件的優(yōu)化

2.2.1 接種量對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響

將腸膜明串珠菌Leuco 4的發(fā)酵種子液以不同接種量接入含有脫脂乳10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、蔗糖5%（w/v）的培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，測(cè)定不同時(shí)間獲得的發(fā)酵液中多糖的含量，接種量對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 接種量對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of inoculation ratio on polysaccharide-production of Leuconostoc mesenteroides Leuco 4

在發(fā)酵前20小時(shí)，不同接種量的發(fā)酵液中多糖含量差異不顯著，說(shuō)明在發(fā)酵初期，Leuco 4在脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中的增殖速率緩慢，不同接種量之間明串珠菌的生長(zhǎng)差異不明顯，因此產(chǎn)生的多糖含量相差不多。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，在20h至80h這段時(shí)間里，不同接種量的發(fā)酵液中多糖含量均呈明顯上升趨勢(shì)，菌株代謝蔗糖產(chǎn)多糖的能力逐漸增強(qiáng)。從圖中可以看出，在相同的取樣時(shí)間點(diǎn)，接種量越大的發(fā)酵液中多糖含量越高，如56h的各發(fā)酵液中多糖含量分別為：4.6g/L（0.5%）、8.0 g/L（1.0%）、9.5 g/L（2.0%）、9.9 g/L（4.0%）。

當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于80 h時(shí)，各發(fā)酵液中累積的多糖總量不再增加，說(shuō)明Leuco合成與消耗多糖的速率達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，導(dǎo)致單位體積的發(fā)酵液中多糖總量也慢慢開(kāi)始趨于穩(wěn)定或減少量。

比對(duì)2.0%（體積分?jǐn)?shù)）和4.0%（體積分?jǐn)?shù)）接種量的發(fā)酵液中多糖含量后發(fā)現(xiàn)，兩者對(duì)Leuco 4的產(chǎn)糖量影響無(wú)顯著差異（P＞0.05）。考慮到工業(yè)化生產(chǎn)的效率和經(jīng)濟(jì)因素，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用2.0%（體積分?jǐn)?shù)）接種量作為最適接種量。

2.2.2 脫脂乳濃度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響

將腸膜明串珠菌Leuco 4的發(fā)酵種子液以2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量分別接入脫脂乳含量為6%、8%、10%、12%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），蔗糖含量為5%（w/v）的脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵終點(diǎn)處的發(fā)酵液中多糖含量，脫脂乳濃度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 脫脂乳濃度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of skimmed milk concentration on polysaccharideproduction of Leuconostoc mesenteroides Leuco 4

不同脫脂乳濃度的發(fā)酵液中多糖含量處于同一水平，分別為：6.3 g/L（6%），6.4 g/L（8%），6.7 g/L（10%），6.2 g/L（12%），以上數(shù)據(jù)顯示脫脂乳濃度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響不顯著（P＞0.05），考慮到脫脂乳濃度10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的發(fā)酵液中多糖含量相對(duì)較高，因此，選用10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為最適脫脂乳濃度。2.2.3 蔗糖濃度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響

分別將腸膜明串珠菌Leuco 4種子液以2%的接種量接入脫脂乳含量為10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），蔗糖含量為2.5%、5.0%、7.5%、10%（w/v）的脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵終點(diǎn)處的發(fā)酵液中多糖含量，蔗糖濃度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 蔗糖濃度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of sucrose concentration on polysaccharideproduction of Leuconostoc mesenteroides Leuco 4

蔗糖濃度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響可能與培養(yǎng)基中代謝底物充分度和滲透壓大小的有關(guān)。不難理解，過(guò)低的蔗糖濃度會(huì)因代謝底物不充足而使多糖產(chǎn)量縮減，過(guò)高的蔗糖濃度則會(huì)因滲透壓過(guò)高而降低Leuco 4細(xì)胞膜的通透性，從而降低了菌株的活力，同樣會(huì)影響目標(biāo)產(chǎn)物的合成。從圖4中可知，腸膜明串珠菌Leuco 4在蔗糖濃度5%（w/v）的脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中代謝蔗糖產(chǎn)生的多糖含量最高，為7.1 g/L，說(shuō)明蔗糖濃度5%（w/v）的培養(yǎng)基對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4而言代謝底物充沛、滲透壓力適中，是Leuco 4發(fā)酵產(chǎn)多糖的最佳蔗糖濃度。

2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響

將腸膜明串珠菌Leuco 4種子液以2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接入上述方法制備的脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中，該脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中含脫脂乳10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），蔗糖5%（w/v），分別置于25、28、31、34℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵終點(diǎn)處的發(fā)酵液中多糖含量，發(fā)酵溫度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)腸膜明串珠菌Leuco 4多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on polysaccharideproduction of Leuconostoc mesenteroides Leuco 4

如圖5所示，腸膜明串珠菌Leuco 4在28℃條件下在相同濃度的脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中合成與積累多糖的能力最強(qiáng)。這可能是由于28℃發(fā)酵有利于Leuco 4利用蔗糖代謝產(chǎn)生胞外多糖。因此，28℃是腸膜明串珠菌Leuco 4的最優(yōu)發(fā)酵溫度。

2.2.5 腸膜明串珠菌Leuco 4在脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基和化學(xué)合成培養(yǎng)基中的產(chǎn)糖能力比較

將腸膜明串珠菌Leuco 4種子液以2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接入脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基和純化學(xué)培養(yǎng)基中，該脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中含脫脂乳10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），蔗糖5%（w/v），28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)120 h，測(cè)定不同時(shí)間獲得的發(fā)酵液中多糖的含量，Leuco 4在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)糖能力比較見(jiàn)圖6。

圖6 腸膜明串珠菌Leuco 4在脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基和化學(xué)合成培養(yǎng)基中的產(chǎn)糖能力Fig.6 Polysaccharide-production of Leuconostoc mesenteroides Leuco 4 fermenting in skimmed milk-sucrose meida and chemically defined medium

從發(fā)酵時(shí)間來(lái)看，腸膜明串珠菌Leuco 4在化學(xué)合成培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)多糖的峰值出現(xiàn)在32 h，而在脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中達(dá)到峰值耗時(shí)80 h，上述數(shù)據(jù)表明Leuco 4在化學(xué)合成培養(yǎng)基中的增殖速率顯著高于脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基，這可能是兩者組分構(gòu)架的差異性造成的。在化學(xué)合成培養(yǎng)基中含有的營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)全面和充足，蛋白胨、酵母抽提物等一應(yīng)俱全，而脫脂乳中有營(yíng)養(yǎng)組分相對(duì)單一和貧乏，只有乳蛋白、乳糖、乳礦物鹽和少量維生素，因此，前者對(duì)Leuco 4促生長(zhǎng)作用更強(qiáng)，其產(chǎn)糖量也隨著菌株的迅速繁殖而大大增強(qiáng)。

從多糖產(chǎn)量來(lái)看，Leuco 4發(fā)酵化學(xué)合成培養(yǎng)基的多糖為9.5 g/L，而在脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基中該產(chǎn)量可高達(dá)11.5 g/L，這可能是脫脂乳中的乳蛋白與乳礦物鹽協(xié)同發(fā)揮了緩沖作用的結(jié)果，一定程度緩和了菌株代謝產(chǎn)酸破壞生境的狀況，從而大大提高了菌株的存活率，因此，最終累積的多糖量更高。

3 討論

從上個(gè)世紀(jì)中期開(kāi)始，對(duì)明串珠菌進(jìn)行了廣泛的研究，包括化學(xué)合成培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)[19]、細(xì)菌素的產(chǎn)生[20]、在乳中與乳球菌的共同發(fā)酵特性[21]等，這些研究成果為明串珠菌的應(yīng)用提供了扎實(shí)的理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。此外，隨著各種高通量篩選模型的出現(xiàn)[22]，具有各種功能的明串珠菌相繼被發(fā)掘（Leuconostoc mesenteroides CMG713[23]，Leuconostoc palmae sp.nov.TMW 2.694T[24]，Leuconostoc mesenteroides FT045B[25]等）。

然而，有關(guān)提高明串珠菌多糖產(chǎn)量的報(bào)道相對(duì)較少。C Moulis（2006年）運(yùn)用分子生物學(xué)的方法，利用大腸桿菌來(lái)表達(dá)Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F的蔗糖酶序列，獲得了穩(wěn)定、高活性的目標(biāo)產(chǎn)物[26]。A Majumder則通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)化學(xué)合成培養(yǎng)基中的11種營(yíng)養(yǎng)組分進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)吐溫、蔗糖和H2PO4是影響Leuconostoc dextranicum NRRL B-1146蔗糖酶產(chǎn)量的關(guān)鍵因素[27]，在蔗糖5.95%、蛋白胨0.52%、酵母抽提物2.9%的培養(yǎng)基中Leuconostoc dextranicum NRRL B-1146發(fā)酵產(chǎn)糖能力最強(qiáng)，為1 063 mg/L[28]。A Singh（2009） 借助紫外線照射的方法來(lái)誘導(dǎo)Leuconostoc dextranicum NRRL B-1146突變，最終篩選得到一株多糖產(chǎn)量高于出發(fā)菌株5倍的突變株[29]。不難發(fā)現(xiàn)，上述報(bào)道無(wú)一例外地以化學(xué)合成培養(yǎng)基為明串珠菌的發(fā)酵基料，而用天然食品為基料產(chǎn)糖至今無(wú)報(bào)道。

本文以一株自主篩選獲得并保藏的腸膜明串株菌Leuco 4為基礎(chǔ)，研究其在脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基糖特性，結(jié)果表明，在脫脂乳濃度10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、蔗糖濃度5%（w/v）、接種量2%（v/w）、發(fā)酵溫度28℃的條件下，180 r/min搖床發(fā)酵80 h的脫脂乳蔗糖發(fā)酵液中多糖含量可達(dá)到11 g/L以上，產(chǎn)糖量高于化學(xué)合成培養(yǎng)基，但產(chǎn)糖過(guò)程相對(duì)緩慢。鑒于這類(lèi)天然產(chǎn)物來(lái)源的多糖在食品安全方面的應(yīng)用潛力越來(lái)越大，有關(guān)明串珠菌Leuco 4快速發(fā)酵脫脂乳蔗糖培養(yǎng)基產(chǎn)糖的研究值得進(jìn)一步的展開(kāi)。

4 結(jié)論

采用M17蔗糖瓊脂的方法，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選到一株高產(chǎn)多糖的明串菌株Leuco 4，經(jīng)鑒定為腸膜明串珠菌（CGMCC NO.6432）；該菌在脫脂乳濃度10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、蔗糖濃度5%（w/v）、接種量2%（v/ w）、發(fā)酵溫度28℃的條件下，180 r/min搖床發(fā)酵80 h后，多糖產(chǎn)量可達(dá)到11 g/L以上。

[1]AI L Z,ZHANG H,GUO B H,et al.Preparation,partial characterization and bioactivity of exopolysaccharides from Lactobacillus casei LC2W[J].Carbohydr Polym,2008,74(3):353-357

[2]PATEL S,MAJUMDER A,GOYAL A.Potentials of exopolysaccharides from lactic acid bacteria[J].Indian Journal of Microbiology, 2012,52(1):3-12

[3]RUFFING A M,CHEN R R.Transcriptome profiling of a curdlanproducing Agrobacterium reveals conserved regulatory mechanisms of exopolysaccharide biosynthesis[J].Microbial Cell Factories,2012, 11:17

[4]DJORDJEVIC S P,CHEN H,BATLEY M,et al.Nitrogen fixation ability of exopolysaccharide synthesis mutants of Rhizobium sp. strain NGR234 and Rhizobium trifolii is restored by the addition of homologous exopolysaccharides[J].Journal of bacteriology,1987, 169(1):53-60

[5]LEIGH J A,WALKER G C.Exopolysaccharides of Rhizobium:Synthesis,regulationandsymbioticfunction[J].Trends in Genetics,1994, 10(2):63-67

[6]VEDAMUTHU E R.The Dairy Leuconostoc:Use in Dairy Products [J].Journal of Dairy Science,1994,77(9):2725-2737

[7]AI L-Z,GUO B-H,ZHANG H,et al.Isolation and antihypertensive effect of exopolysaccharides from Lactobacillus casei LC2W[J]. Milchwissenschaft-Milk Science International,2008,63(1):3-6

[8]DE VUYST L,DEGEEST B.Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria[J].FEMS Microbiology Reviews,1999,23(2):153-177

[9]RUAS-MADIEDO P,HUGENHOLTZ J,ZOON P.An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria[J].International Dairy Journal,2002,12(2/3):163-171

[10]AGARWAL K N,BHASIN S K.Feasibility studies to control acute diarrhoea in children by feeding fermented milk preparations Ac－timel and Indian Dahi[J].European Journal of Clinical Nutrition, 2002,56:S56-S59

[11]VON WEYMARN N,HUJANEN M,LEISOLA M.Production of D-mannitol by heterofermentative lactic acid bacteria[J].Process Biochemistry,2002,37(11):1207-1213

[12]SYBESMA W,STARRENBURG M,TIJSSELING L,et al.Effects of cultivation conditions on folate production by lactic acid bacteria [J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(8):4542-4548

[13]HUANG D Q,PREVOST H,DIVIES C.Principal characteristics of alpha-galactosidase from Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides[J].Journal of Basic Microbiology,1994,34(2):87-95

[14]STILES M E.Bacteriocins Produced by Leuconostoc Species[J]. Journal of Dairy Science,1994,77(9):2718-2724

[15]HEMME D,FOUCAUD-SCHEUNEMANN C.Leuconostoc,characteristics,use in dairy technology and prospects in functional foods [J].International Dairy Journal,2004,14(6):467-494

[16]LIU S Q,ASMUNDSON R V,HOLLAND R,et al.Acetaldehyde metabolism by Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris under stress conditions[J].International Dairy Journal,1997,7(2/3):175-183

[17]MONCHOIS V,WILLEMOT R-M,MONSAN P.Glucansucrases: Mechanism of action and structure-function relationships[J].FEMS Microbiology Reviews,1999,23(2):131-151

[18]KORAKLI M,VOGEL R F.Structure/function relationship of homopolysaccharide producing glycansucrases and therapeutic potentialoftheirsynthesisedglycans[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2006,71(6):790-803

[19]KIM Y J,EOM H-J,SEO E-Y,et al.Development of a chemically defined minimal medium for the exponential growth of Leuconostoc mesenteroides ATCC8293[J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2012,22(11):1518-1522

[20]H CHARD Y,D RIJARD B,LETELLIER F,et al.Characterization and purification of mesentericin Y105,an anti-Listeria bacteriocin from Leuconostoc mesenteroides[J].Journal of General Microbiology,1992,138(12):2725-2731

[21]BELLENGIER P,RICHARD J,FOUCAUD C.Associative growth of Lactococcus lactis and Leuconostoc mesenteroides strains in milk [J].Journal of Dairy Science,1997,80(8):1520-1527

[22]BENKERROUM N,MISBAH M,SANDINE W E,et al.Development and use of a selective medium for isolation of Leuconostoc spp. from vegetables and dairy products[J].Applied and environmental microbiology,1993,59(2):607-609

[23]SARWAT F,UL QADER S A,AMAN A,et al.Production&characterization of a unique dextran from an indigenous Leuconostoc mesenteroides CMG713[J].International Journal of Biological Sciences,2008,4(6):379-386

[24]EHRMANN M A,FREIDING S,VOGEL R F.Leuconostoc palmae sp nov.,a novel lactic acid bacterium isolated from palm wine[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009,59:943-947

[25]PALMUTI BRAGA VETTORI M H,MARTINS FRANCHETTI S M, CONTIERO J.Structural characterization of a new dextran with a low degree of branching produced by Leuconostoc mesenteroides FT045B dextransucrase[J].Carbohydr Polym,2012,88(4):1440-1444

[26]MOULIS C,ARCACHE A,ESCALIER P-C,et al.High-level production and purification of a fully active recombinant dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F[J].Fems Microbiology Letters,2006,261(2):203-210

[27]MAJUMDER A,GOYAL A.Enhanced production of exocellular glucansucrase from Leuconostoc dextranicum NRRL B-1146 using response surface method[J].Bioresource Technology,2008,99(9): 3685-3691

[28]MAJUMDER A,SINGH A,GOYAL A.Application of response surface methodology for glucan production from Leuconostoc dextranicum and its structural characterization[J].Carbohydr Polym,2009, 75(1):150-156

[29]SINGH A,MAJUMDER A,GOYAL A.Mutagenesis of Leuconostoc dextranicum NRRL B-1146 for higher glucan production[J].Inter J Microbiol,2009,7(1):1-7

Screening，Identification and Polysaccharide Biosynthesis Condition Optimization of Leuconostoc mesenteroides Leuco 4

HAN Jin，WU Zheng-jun，JI Hong，GAO Cai-xia，YOU Chun-ping
（State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Bright Dairy&Foods Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

A bacterial strain Leuco-4 capable of expressing high yield of exopolysaccharide on M17-sucrose agar was isolated from pickles of Yunnan and was identified as Leuconostoc mesenteroides（CGMCC NO.6432）.The optimized conditions for Leuco 4 to biosynthesize polysaccharides was found to be a combination of 10%（w/w）skimmed milk，sucrose concentration of 5%（w/v），inoculation ratio of 2%（v/w），fermentation temperature of 28℃，respectively.After cultivated aerobically at shaker of 180 r/min for 80 hours under the optimized conditions，the polysaccharide in the fermentation broth of L.mesenteroides Leuco-4 reached 11 g/L.

Leuconostoc mesenteroides Leuco 4；skimmed milk-sucrose media；polysaccharide

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.030

2013-07-01

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題：發(fā)酵乳制品乳酸菌菌種與發(fā)酵劑的研究與開(kāi)發(fā)（2013BAD18B01）；“十二五”國(guó)家863項(xiàng)目：優(yōu)良益生菌高效篩選與應(yīng)用關(guān)鍵技術(shù)（2011AA100901）

韓瑨（1980—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：乳品科學(xué)專(zhuān)業(yè)。