張賽樂王雪鵬閆茂倉柴雪良艾為明謝起浪*

（①浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江 溫州 325005）

②山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安 ③溫州生命科學(xué)學(xué)院 溫州醫(yī)學(xué)院海洋科學(xué)研究所）

文蛤抗菌物質(zhì)的粗提及活性檢測

張賽樂①王雪鵬②閆茂倉①柴雪良①艾為明③謝起浪①*

（①浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江 溫州 325005）

②山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安 ③溫州生命科學(xué)學(xué)院 溫州醫(yī)學(xué)院海洋科學(xué)研究所）

為了分離純化得到文蛤體內(nèi)的抗菌活性蛋白，以滅活的副溶血弧菌誘導(dǎo)的方法，通過紫外分光光度計(jì)法測定其粗提品的蛋白質(zhì)含量，并進(jìn)行抗菌活性檢測，同時(shí)利用硫酸銨沉淀法對粗提物進(jìn)一步純化、SDS-PAGE電泳檢測純度。結(jié)果顯示，文蛤經(jīng)副溶血弧菌誘導(dǎo)后，產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，大約在4h時(shí)對大腸桿菌抑制率最高；誘導(dǎo)4h時(shí)抑制率與對照相比無顯著差異(P＞0.05)。在經(jīng)過硫酸銨沉淀后，SDS-PAGE電泳顯示條帶較多；進(jìn)行Sephadex G-50凝膠過濾層析的最佳條件為洗脫流速0.2ml/min、樣品濃度3.0mg/ml。

文蛤 抗菌物質(zhì) 硫酸銨沉淀 活性檢測 凝膠層析

海洋是生命的搖籃，其面積約占地球表面積的71%。目前已知的海洋生物有21萬種，由于海洋環(huán)境的特殊性(高鹽、高壓、低營養(yǎng)、低溫、無光照)，迫使海洋生物產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)獨(dú)特并有顯著生物活性的代謝產(chǎn)物以適應(yīng)嚴(yán)酷的環(huán)境，主要活性表現(xiàn)在抗菌、抗病毒、抗凝血、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤和抗心血管疾病等方面。我國海洋資源豐富，為海洋藥物的研究與開發(fā)提供了優(yōu)越的基礎(chǔ)[1]。

在我國，文蛤(Meretrix meretrix)是一種天然資源豐富的灘涂貝類，為沿海主要的灘涂養(yǎng)殖貝類，是重要的海水增養(yǎng)殖優(yōu)良品種，也是主要出口的鮮活水產(chǎn)品之一[2]。其經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美。文蛤不僅肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，而且具有很高的食療藥用價(jià)值。李時(shí)珍的《本草綱目》上說，它能治"瘡、癤腫毒，消積塊，解酒毒"等病。近代研究又表明：文蛤有清熱利濕、化痰、散結(jié)的功效，對肝癌有明顯的抑制作用，對哮喘、慢性氣管炎、甲狀腺腫大、淋巴結(jié)核等病也有明顯療效。目前，國內(nèi)外學(xué)者也開展了文蛤中蛋白質(zhì)和多糖等活性物質(zhì)提取和分析的研究工作，也證實(shí)了文蛤中富含肽類等抗腫瘤活性成分。而近年來關(guān)于文蛤抗菌肽的研究未見報(bào)道。本文以滅活的副溶血弧菌為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)，采用大腸桿菌(Escherichia coli)作為指示菌，對文蛤的組織提取物進(jìn)行抗菌活性測定?？蔀闉┩控愵惪咕幕蚬こ坍a(chǎn)品(抗菌藥物)的開發(fā)研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)用文蛤(Meretrix meretrix)購于浙江省溫州市龍灣區(qū)某養(yǎng)殖場，于沙濾海水中暫養(yǎng)7d后進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，具有強(qiáng)致病性；大腸桿菌(Escherichia coli)為購買的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922。

1.2 副溶血弧菌誘導(dǎo)物的制備 副溶血弧菌菌株接種于Zobell 2216E斜面，28℃培養(yǎng)24h，用0.65%生理鹽水洗下菌苔，加入終濃度為0.3%的甲醛滅活24h后，用TCBS培養(yǎng)基檢測滅活效果。確認(rèn)徹底滅活后，用0.65%生理鹽水洗3次，配成終濃度為1×107cfu/ml滅活副溶血弧菌的海水用于誘導(dǎo)。

1.3 誘導(dǎo) 將文蛤浸泡在1×107cfu/ml滅活副溶血弧菌的海水中，定期采集組織。

1.4 取樣 于誘導(dǎo)0、4、8、12和24h后(分別為對照組、P1、P2、P3和P4組)取0.50kg的文蛤去殼，將組織剪碎勻漿，勻漿液4℃保存。

1.5 抗菌物質(zhì)的提取 勻漿液中按體積比1:1加入5%乙酸，4℃攪拌過夜，次日將混合物于4℃、5000r/min離心30min，取上清，4℃保存。將沉淀物用等體積5%乙酸混合，再次4℃攪拌浸提過夜。重復(fù)上述離心過程，取上清，合并2次上清液，調(diào)節(jié)pH為7.0，再離心，棄沉淀，收集上清液，即為粗提品，-20℃保存，部分產(chǎn)物冷凍干燥保存。

1.6 蛋白質(zhì)含量的測定 采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量：總蛋白質(zhì)含量(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260×稀釋倍數(shù)。

1.7 硫酸銨沉淀 將凍存的誘導(dǎo)4h制備的粗提物樣品取出，4℃下融化，滴加等體積飽和硫酸銨溶液使其飽和度達(dá)50%，4℃靜置過夜后離心得到沉淀物，用原1/2體積PBS緩沖液溶解，并透析除鹽。

1.8 抗菌試驗(yàn) 采用微量比濁法[3-5]，菌懸液的制備取細(xì)菌菌種接于Zobell 2216E液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)16h后，以Zobell 2216E液基調(diào)整菌濃度到104cfu/ml，備用。取96孔板，每孔加入10μl抗菌提取物、硫酸銨沉淀產(chǎn)物，然后每孔中加入90μl菌懸液，28℃培養(yǎng)12h。同時(shí)設(shè)置作生長對照和重復(fù)。用酶標(biāo)儀于450nm處，測定吸光度值。

1.9 Tris-Glycine SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測[6]（1）制膠：參照寶生物工程(大連)有限公司提供的配方，配制濃縮膠、分離膠的濃度分別為5%和12%，緩沖體系為Tris-Glycine體系。（2）制樣：將樣品溶于樣品緩沖液，100℃沸水浴5～10min，5000r/min離心5min，取上清用微量加樣器上樣。（3）電泳：80V恒壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示帶達(dá)到分離膠時(shí)，加大電壓至140V。（4）染色：取出凝膠，放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中，染色1～2h。（5）脫色：傾去染色液，以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動(dòng)直至獲得藍(lán)色條帶及干凈的背景。

1.10 Sephadex G-50凝膠過濾層析 試驗(yàn)采用Sephadex G-50凝膠柱，用PBS緩沖液進(jìn)行平衡。取500μl鹽析產(chǎn)物上樣，在280nm紫外下監(jiān)測洗脫情況。

2 結(jié)果

2.1 總蛋白質(zhì)含量 乙酸抽提所得的粗提品顏色均為淡黃色、透明溶液，其總蛋白質(zhì)含量在誘導(dǎo)呈先升高后降低的趨勢。

表1 不同誘導(dǎo)時(shí)間粗提品的理化性質(zhì)及蛋白質(zhì)含量 (mg/ml)

2.2 抗菌活性試驗(yàn) 采用微量比濁法，以大腸桿菌作指示菌，根據(jù)吸光度值計(jì)算生長抑制率IR(%)，IR(%)=(1-A/A0)×100%，其中A為實(shí)驗(yàn)組的吸光度值，A0為生長對照組的吸光度值。

表2 不同誘導(dǎo)時(shí)間粗提品的抗菌活性

由表2看出，文蛤經(jīng)副溶血弧菌誘導(dǎo)后，產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，大約在4 h時(shí)抑制率最高。

表3 不同誘導(dǎo)時(shí)間鹽析組分的抗菌活性

由表3得知，文蛤粗提品經(jīng)硫酸銨沉淀后所得產(chǎn)物均具有抗菌活性，且其抑制率有不同程度的提高，說明鹽析產(chǎn)物中抗菌物質(zhì)含量相較粗提品有所升高，為進(jìn)一步純化奠定基礎(chǔ)。

圖1 不同誘導(dǎo)時(shí)間粗提品的SDS-PAGE電泳圖譜

圖2 不同誘導(dǎo)時(shí)間鹽析組分的SDS-PAGE電泳圖譜

2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果 通過SDS-PAGE電泳圖譜1、2比較可知，粗提品蛋白條帶比較多，經(jīng)過硫酸銨沉淀后得到的產(chǎn)物條帶相對比較清晰，但仍有雜蛋白存在，還需要通過其他方法來進(jìn)一步提純，如離子交換、凝膠層析、親和層析等。

2.4 Sephadex G-50凝膠過濾層析 凝膠過濾層析效果受多種因素影響[7]，采用經(jīng)4h誘導(dǎo)后制備的鹽析組分為上樣液比較洗脫流速與樣品濃度對Sephadex G-50分離文蛤抗菌蛋白效果的影響。（1）不同洗脫流速對Sephadex G-50分離文蛤抗菌蛋白效果的影響。其它層析條件不變的情況下，本試驗(yàn)選擇了4個(gè)不同洗脫流速，0.1ml/min、0.2ml/min、1.0ml/min的分離曲線。當(dāng)流速為1.0ml/min時(shí)，由于流速過快，出峰相對較快，一些小峰不能分開；流速為0.1ml/min時(shí)，雖能到達(dá)最好的分離效果，但由于低流速導(dǎo)致工作效率降低。因此選擇0.2ml/min作為最佳洗脫流速。（2）不同樣品濃度對Sephadex G-50分離文蛤抗菌蛋白效果的影響。在其他層析條件固定的情況下，選擇了1.0mg/ml與3.0mg/ml 2個(gè)不同的樣品濃度進(jìn)行分離。樣品濃度過低，如1.0mg/ml，使洗脫出來的分離組分吸光度降低，即濃度降低，影響分離的效率，并給以后的樣品出來帶來不便。因此選擇3.0mg/ml作為最佳樣品濃度。

3 討論

在貝類的免疫系統(tǒng)中，除了以通過吞噬作用完成的細(xì)胞免疫外，血淋巴中的溶酶體酶、凝集素、非特異性抗菌肽等體液因子也發(fā)揮了重要的防御作用[8,9]。近年來，雙殼貝類的抗菌物質(zhì)成為研究的一個(gè)熱點(diǎn)。郭道森等[10]從毛蚶(Scapharca subcrenata)血漿中分離的抗菌蛋白對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、四連微球菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，且該抗菌蛋白具有很好的熱穩(wěn)定性，對胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感；Maurice等[11]從貽貝(Mytilus Edulis)血液中分離出一類富含半胱氨酸的防御素Mytilin A，具有抗革蘭氏陰性和陽性菌活性，且能殺滅部分真菌；洪旭光[4]從櫛孔扇貝(Chlamys farreri)血液純化出一種全新的抗菌肽(其分子量為2000Da)，不僅有抗真菌活性，還有潛在的抑制腫瘤的作用；Jung-Kil Seo[12]從美國耗(Crassostrea virginica)鰓組織中純化得到cvH2B.，其氨基酸序列被認(rèn)定為與組蛋白H2B相似，夠抑制包括副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌在內(nèi)的革蘭氏陰性菌。雙殼貝類抗菌物質(zhì)的研究對利用其以治療外界微生物入侵引起的疾病有重大的作用。

文蛤生活在灘涂中，且飼養(yǎng)環(huán)境也不是無菌，故在養(yǎng)殖期間內(nèi)不可避免有一定的細(xì)菌生長，這可能導(dǎo)致對照與誘導(dǎo)4h時(shí)的抗菌物質(zhì)對大腸桿菌生長的抑制作用無顯著差異。至于該抗菌物質(zhì)是否為飼養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)菌進(jìn)入文蛤體內(nèi)后刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生，還需要進(jìn)一步研究。粗提品對大腸桿菌有一定的抑制作用，副溶血弧菌誘導(dǎo)后大約在4h達(dá)到高峰，隨后抑制率逐漸降低；經(jīng)硫酸銨沉淀后，通過兩次SDS-PAGE電泳對比發(fā)現(xiàn)，純度有所提高，也可由兩次的抗菌活性試驗(yàn)推斷得知。但鹽析產(chǎn)物SDS-PAGE電泳顯示仍有較多蛋白條帶，還需進(jìn)一步純化。

本研究選用了Sephadex G-50Fine，其分子量分級范圍為：球蛋白1500～30000，初步探討了洗脫流速和樣品濃度對Sephadex G-50分離文蛤抗菌物質(zhì)效果的影響，洗脫流速過快無法分開一些小峰樣品，但流速過慢導(dǎo)致工作效率降低；濃度過低易影響分離的效率，且對后續(xù)的樣品處理造成不便。另外，凝膠層析分離效果還與葡聚糖凝膠類型、樣品的粘度[7]等有關(guān)。本研究工作的開展為后續(xù)進(jìn)行文蛤的活性跟蹤，確定其抗菌活性成分，發(fā)現(xiàn)新的抗菌物質(zhì)提供了一定的線索。

[1] 管華詩, 耿美玉, 王長云. 21世紀(jì)中國海洋藥物[J]. 中國海洋藥物, 2000(4): 44-47.

[2] 王如才, 王昭萍. 海水貝類養(yǎng)殖學(xué)[M]. 青島: 青島海洋大學(xué), 1993.

[3] Tommy Baumann, Urs K?mpfer, Stefan Schürch, et al. Ctenidins: antimicrobial glycine-rich peptides from the hemocytes of the spider Cupiennius salei[J]. Cell. Mol. Life Sci., 2010, 67(16): 2787-2798.

[4] 洪旭光. 皺紋盤鮑和櫛孔扇貝抗菌肽的研究[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2008.

[5] 張鉑, 吳梧桐. 抗腫瘤文蛤糖肽(MGP0405)的分離純化及性質(zhì)研究[J]. 中國天然藥物, 2006, 4(3): 230-233.

[6] 郭堯君. 蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1999.

[7] 安春菊, 李德森, 趙素然等. 凝膠過濾層析參數(shù)對家蠅蛋白粗提液分離效果的影響[J]. 昆蟲學(xué)報(bào), 2005, 48(1): 139-142.

[8] J. Andy Tincu, Steven W. Taylor. Antimicrobial Peptides from Marine Invertebrates[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, 48(10): 3645-3654.

[9] Mitta G., Hubert F., Vandenbulcke F. Noel T., et al. Myticin, a novel cysteine-rich antimicrobial peptide isolated from haemocytes and plasma of the mussel Mytilus galloprovincialis[J]. Eur.J.Biochem., 1999, 265: 71-78.

[10] 郭道森, 魏玉西, 李麗等. 毛蚶血漿中抗菌蛋白的純化及抗菌活性研究[J]. 海洋科學(xué), 2005,29(3): 25-29.

[11] Maurice Charlet, Serguey Chernysh, Hervé Philippe, et al. Isolation Of Several Cysteine-Rich Antimicrobial Peptides From The Blood Of a Mollusc, Mytilus Edulis[J]. The Journal of Biological Chemstry, 1996, 271(36): 21808-21813.

[12] Jung-Kil Seo, Jeanna Stephenson, J. Myron Crawford, et al. American Oyster, Crassostrea virginica, Expresses a Potent Antibacterial Histone H2B Protein[J]. Mar Biotechnol, 2010, 12:543-551.

S885.3+9

A

1007-1733(2014)07-0003-03

2014–04–09）

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(S20100016), 浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(J201205), 浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012F20029), 中央財(cái)政支持地方高校發(fā)展專項(xiàng)學(xué)科項(xiàng)目(xkc11011), 國家863項(xiàng)目(2012AA10A410-1). 國家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系浙江綜合試驗(yàn)站(CARS-48), 浙江省重大科技專項(xiàng)(2012C12017-3),溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011N0006)

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