趙建云+鄧展進(jìn)+劉瑞珍

[摘要] 目的 研究大麻素CB2受體激動(dòng)劑HU308對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活后NO及IL-6分泌的影響。 方法 體外培養(yǎng)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株（BV-2細(xì)胞），分為對(duì)照組、LPS刺激組及干預(yù)組（LPS+HU308）。通過顯微鏡觀察各組小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，CCK-8法檢測(cè)各組小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況，Griess法檢測(cè)各組NO含量，ELISA法檢測(cè)各組IL-6水平。 結(jié)果 LPS刺激組的小膠質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn)大量胞體增大，偽足粗短或消失的細(xì)胞和一些壞死細(xì)胞，細(xì)胞增殖較差，NO及IL-6表達(dá)水平顯著增高。經(jīng)大麻素CB2受體激動(dòng)劑HU308干預(yù)后，大部分細(xì)胞胞體稍大，偽足尚明顯，細(xì)胞破壞程度輕，增殖較好，炎性因子表達(dá)均明顯下降。 結(jié)論 激動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞表面的大麻素CB2受體，可以減輕LPS造成的小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化或損傷，抑制其炎性因子N0及IL-6的分泌，從而達(dá)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 大麻素CB2受體激動(dòng)劑；HU308；脂多糖；小膠質(zhì)細(xì)胞；NO；IL-6

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）05-36-04

腦血管病繼發(fā)腦損傷，炎癥反應(yīng)起著重要作用[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞，在腦內(nèi)起著免疫監(jiān)視和免疫防御功能[2]，并且對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有支持、營養(yǎng)、保護(hù)和修復(fù)等重要作用[3]。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于相對(duì)靜息狀態(tài)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血、缺氧時(shí)可迅速被激活，大量分泌炎癥因子、一氧化氮（nitric oxide，NO）等分子，參與中樞神經(jīng)損傷的病理發(fā)展過程[4]。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化后的炎癥反應(yīng)可以作為治療腦血管疾病腦損傷的重要途徑之一[5-6]。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)神經(jīng)保護(hù)作用成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)問題。激動(dòng)內(nèi)源性大麻素受體（CB1＼CB2）可減輕動(dòng)物模型局灶性腦缺血和全腦缺血造成的腦損傷[7]，但具體機(jī)制尚不明確。大麻素CB2受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞[8]。本實(shí)驗(yàn)預(yù)通過體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞；研究CB2受體激動(dòng)劑HU308對(duì)脂多糖造成的小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化或損傷后炎癥因子NO、IL-6表達(dá)的影響；探討激動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞表面的CB2受體，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)功能及炎癥反應(yīng)的影響，為神經(jīng)保護(hù)類藥物的研發(fā)提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術(shù)公司）；胎牛血清（四季青，浙江天杭生物科技有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈雙抗、脂多糖（博士德生物公司）；IL-6 ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒及Griess法NO檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；HU-308（Cayman Chemical，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2購于江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術(shù)公司。培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液（含青霉素100 U/mL 和鏈霉素100mg/mL）中，在37℃、5%CO2 恒溫孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈單層貼壁生長，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)收集細(xì)胞，細(xì)胞以4×104～5×104/孔接種于培養(yǎng)板。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、LPS刺激組（LPS濃度為1?g/mL）、LPS聯(lián)合HU308干預(yù)組（LPS濃度1?g/mL，HU308濃度分別1?mol/L、5?mol/L、10?mol/L）。上述五組均干預(yù)12h。

1.4 鏡下觀察

倒置相差顯微鏡10×20倍鏡下觀察各組小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

應(yīng)用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板檢測(cè)細(xì)胞增殖，每孔加入培養(yǎng)基200?L約10000個(gè)細(xì)胞，經(jīng)實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù)12h后，各孔加入20?LCCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)，450nm測(cè)定各孔吸光度值。

1.6 Griess 法檢測(cè)NO的含量

按照說明書Griess 法檢測(cè)NO的含量。取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液50μL加入96孔平底酶標(biāo)板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，依次加入氨基苯磺酸、萘基乙二胺，室溫避光孵育10min，酶標(biāo)儀540nm 波長讀取A值，再依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出NO的含量（濃度）。

1.7 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6含量

按照試劑盒說明書推薦方法測(cè)定。根據(jù)說明書要求配制標(biāo)準(zhǔn)品液、10×標(biāo)本稀釋液及洗滌液。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，96孔酶標(biāo)板中每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃40min，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干；每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50μL（空白除外），將反應(yīng)板充分混勻后置37℃20min，同前洗板；每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μL。將反應(yīng)板置37℃10min，同前洗板；每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗處反應(yīng)15min；每孔加入100μL終止液混勻；30min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/mL為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，使用軟件作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算出相應(yīng)IL-6含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。以（）表示統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，組間比較應(yīng)用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察各組小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化

正常對(duì)照組細(xì)胞體呈圓形或橢圓形，從胞體發(fā)出細(xì)長的突起，表面有許多小棘突，細(xì)胞密度較高；見圖1。LPS刺激組刺激小膠質(zhì)細(xì)胞12h后觀察大量胞體增大，偽足粗短或消失，可見一些壞死細(xì)胞，細(xì)胞密度較低；見圖2。與LPS刺激組比較，LPS聯(lián)合HU308 10?mol/L干預(yù)組，干預(yù)12h后觀察大部分細(xì)胞胞體稍大，偽足尚明顯，細(xì)胞破壞程度輕，密度較高。見圖3。endprint

2.2 HU308對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

表1值結(jié)果顯示，LPS刺激組細(xì)胞增殖較差，與正常對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HU308不同濃度干預(yù)組細(xì)胞增殖較好，濃度為10?mol/L的HU308組細(xì)胞增殖最好，各組與LPS刺激組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HU308對(duì)損傷的小膠質(zhì)細(xì)胞有保護(hù)作用。

2.3 HU308對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子（NO、IL-6）分泌的影響

表1結(jié)果顯示，LPS刺激組的細(xì)胞培養(yǎng)液中NO及IL-6含量顯著升高，與正常對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HU308不同濃度干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO及IL-6含量明顯降低，濃度為10?mol/L的HU308組NO及IL-6含量降低最明顯，與LPS刺激組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HU308對(duì)損傷小膠質(zhì)細(xì)胞NO及IL-6的分泌有抑制作用。

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的固有免疫細(xì)胞和主要效應(yīng)細(xì)胞，一般認(rèn)為，它來源于單核巨噬細(xì)胞系，生理?xiàng)l件下靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞呈分枝狀，僅進(jìn)行簡單的吞噬作用，清除代謝產(chǎn)物，其活性受神經(jīng)元產(chǎn)生的抑制因子如CD200R、CX3CR1 等調(diào)控[9]。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，其形態(tài)呈阿米巴樣改變，具有抗原提呈、調(diào)理吞噬及分泌炎性因子的作用[10]。腦損傷、低氧、缺血以及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。ˋD 和PD），常伴隨著腦內(nèi)炎癥的出現(xiàn)。小膠質(zhì)細(xì)胞激活經(jīng)常被認(rèn)為是神經(jīng)元凋亡的前期標(biāo)志[11]?；罨蟮男∧z質(zhì)細(xì)胞可通過釋放炎性因子等對(duì)神經(jīng)元具有損傷作用[12]。

近些年對(duì)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endocannabinoid system，ECS）的研究成為一個(gè)熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，ECS由內(nèi)源性大麻素、大麻素受體及大麻素生物合成和降解的酶系組成。體內(nèi)存在兩種大麻素受體，即CB1受體和CB2受體[13-14]。CB1受體主要分布在腦、脊髓及外周神經(jīng)系統(tǒng)中，發(fā)揮止痛、鎮(zhèn)靜，參與調(diào)控?cái)z食、脂肪聚集及胰島素抵抗等作用；CB2受體在免疫組織中有豐富的表達(dá)，脾臟邊緣區(qū)、免疫細(xì)胞、扁桃體、胸腺等，起免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用[15-17]。近年大麻素類藥物在臨床應(yīng)用中出現(xiàn)了成癮、抑郁或焦慮等中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)，考慮與CB1受體有關(guān)，部分藥物已被叫停。因此，學(xué)者們開始更關(guān)注對(duì)CB2受體的研究。CB2受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞[18-19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS可引起小膠質(zhì)細(xì)胞活化或損傷，分泌炎性因子NO及IL-6明顯增多；給予CB2受體激動(dòng)劑HU308處理后，可以減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，NO及IL-6分泌也顯著減少，且有劑量依賴性；這一結(jié)果證明激動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞CB2受體可以對(duì)其起保護(hù)作用，并且抑制炎癥反應(yīng)，從而可能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，激動(dòng)大麻素CB2受體，可以對(duì)損傷的小膠質(zhì)細(xì)胞起保護(hù)作用，抑制其過度活化及炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。此研究可以為神經(jīng)保護(hù)類藥物的研發(fā)提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

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