肖 敏，邵從英，葛寶寶，訾言勤

（淮北師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000）

頭孢曲松鈉（Ceftriaxone sodium）（CSI，見圖1）為第三代頭孢菌素類抗菌藥物，與第一、二代相比，其抗菌譜更廣，抗菌活性更強(qiáng)，特別對(duì)革蘭氏陰性桿菌的抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)［1］.胃蛋白酶（Pepsin）是生物上第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物酶，是由胃部的胃粘膜主細(xì)胞所分泌消化酶，能有效地將食物中的蛋白質(zhì)分解為小的肽片段.因胃蛋白酶在醫(yī)學(xué)上對(duì)人體有巨大作用，所以在醫(yī)療和醫(yī)藥方面人們投入更多的研究［2-3］.

圖1 頭孢曲松鈉的分子式Fig.1 The structure of ceftriaxone sodium

本實(shí)驗(yàn)探討頭孢曲松鈉與胃蛋白酶的主要作用力類型和熱力學(xué)函數(shù)的變化，同時(shí)計(jì)算反應(yīng)結(jié)合常數(shù)k與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，利用同步熒光法對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象影響進(jìn)行考察，旨在為醫(yī)學(xué)和藥學(xué)等方面提供有用信息.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

FP-8300 型（日本島津）熒光分光光度計(jì)；FA-2004 型（上海良平）電子天平；TU-1901 型（北京普析）雙光束紫外可見分光光度計(jì)；pHS-3D型（上海虹益）精密pH計(jì)；HH-4型（國華電器）數(shù)顯恒溫水浴鍋；注射用頭孢曲松鈉（汕頭金石粉針劑有限公司，分子量628.6）：配制100 mL的1.0×10-4mol·L-1備用液；胃蛋白酶（南京海辰藥業(yè)有限公司，分子量35 000）：配制250 mL的2.1×10-4mol·L-1；配制pH 1.81 B-R緩沖溶液；所用試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純，冰箱1～4 ℃保存；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

向10 mL試管中依次加入pH 1.81的B-R緩沖溶液1.00 mL，胃蛋白酶溶液1.00 mL，以及系列濃度的頭孢曲松鈉溶液，定容混合均勻后，靜置20 min，進(jìn)行測(cè)定.在熒光光度計(jì)上（激發(fā)波長(zhǎng)277 nm，夾縫寬度均為5 nm），記錄在不同溫度下290～500 nm 范圍內(nèi)熒光發(fā)射光譜.并且在298 K 時(shí)，記錄Δλ=15 nm 與Δλ=60 nm的同步熒光光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅機(jī)制探討

固定胃蛋白酶的濃度，加入系列濃度的頭孢曲松鈉，胃蛋白酶的熒光強(qiáng)度有規(guī)律地下降（如圖2），表明頭孢曲松鈉對(duì)胃蛋白酶有猝滅效果，兩者發(fā)生相互作用.熒光猝滅的機(jī)制主要有靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅兩種，且均滿足Stem-Volmer方程［4］：

圖2 頭孢曲松鈉和胃蛋白酶體系的熒光猝滅光譜Fig.2 The fluorescence emission spectra of pepsin in presence of CSI，T=298 K，pH=1.81

在溫度分別298 K，303 K及308 K的條件下，以F0/F對(duì)［Q］作圖得圖3：

圖3 頭孢曲松鈉和胃蛋白酶體系的Stern-Volmer方程曲線

由圖3b知，在3個(gè)不同溫度下，胃蛋白酶與頭孢曲松鈉作用均是向上彎曲的曲線；而圖3a可以看出，從0到1.75×10?4mol·L?1低濃度區(qū)間，兩者作用得到良好的直線線性關(guān)系，由Sterm-volmer方程求得該體系的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，數(shù)據(jù)列于表1中.

表1 胃蛋白酶與頭孢曲松鈉作用的擴(kuò)散碰撞的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Table1 Stern–Volmer quenching constants for pepsin-CSI system at different temperatures，pH1.81

由表1可看出，不同溫度下的Kq值均大于最大動(dòng)態(tài)擴(kuò)散碰撞速率常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1；然而隨著溫度的升高，Stern-Volmer猝滅常數(shù)Ksv增大，頭孢曲松鈉與胃蛋白酶作用機(jī)制表現(xiàn)為動(dòng)態(tài)猝滅.因此，推斷頭孢曲松鈉和胃蛋白酶的熒光猝滅過程可能是一個(gè)動(dòng)態(tài)猝滅為主的過程［5］.

2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)

在猝滅過程中，胃蛋白酶與頭孢曲松鈉的結(jié)合常數(shù)可由熒光體和猝滅劑的結(jié)合常數(shù)表達(dá)式導(dǎo)出［6］：

以lg［（F0-F）/F］對(duì)lg［CSI］作圖，得到圖4：

圖4 頭孢曲松鈉與胃蛋白酶結(jié)合雙對(duì)數(shù)圖Fig.4 Double-lg plot at different temperature

由（2）式可求得結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，見表2.

表2 頭孢曲松鈉與胃蛋白酶在不同溫度下的熱力學(xué)常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nTable 2 Thermodynamic parameters，numbers of binding sites n for pepsin-CSI system at different temperatures

由表2可見，頭孢曲松鈉和胃蛋白酶之間存在強(qiáng)烈的相互作用，且隨著溫度的升高，結(jié)合常數(shù)不斷增大，也進(jìn)一步判斷其猝滅機(jī)制為動(dòng)態(tài)猝滅，同時(shí)可以看出頭孢曲松鈉和胃蛋白酶之間只有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn).

2.3 熱力學(xué)函數(shù)及結(jié)合作用力

在298 K、303 K和308 K 3個(gè)溫度下，依據(jù)熱力學(xué)參數(shù)方程式（3）-（5）即可計(jì)算出頭孢曲松鈉和胃蛋白酶結(jié)合的ΔH、ΔG、ΔS等熱力學(xué)函數(shù)值如表2.

根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)可以簡(jiǎn)單地判斷其相互作用力的類型［7］，表2中ΔG＜0表明在頭孢曲松鈉和胃蛋白酶的結(jié)合過程是一個(gè)自發(fā)的過程，ΔH＞0，且ΔS＞0，表明二者結(jié)合是一個(gè)吸熱的熵增的過程，由此可以推測(cè)該體系中頭孢曲松鈉和胃蛋白之間的作用力主要是疏水作用力.

2.4 體系的能量轉(zhuǎn)移及結(jié)合距離的計(jì)算

根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論［8］，供體和受體之間的結(jié)合距離R及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0之間的關(guān)系為［9-10］：

圖5 頭孢曲松鈉紫外吸收光譜Fig.5 The overlap of the UV absorption spectrum of CSI

圖5為頭孢曲松鈉的紫外吸收光譜與胃蛋白酶的熒光光譜圖.通過（6）-（8）式，對(duì)圖5中的光譜重疊部分的面積進(jìn)行積分求和，可得光譜的重疊積分為J=4.188 6×10-16cm3·L·mol-1，得到它們的距離r=0.92 nm，小于8 nm［11］.表明在頭孢曲松鈉和胃蛋白酶作用時(shí)，二者發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移.

2.5 同步熒光的構(gòu)象變化

圖6為頭孢曲松鈉和胃蛋白酶體系的同步熒光光譜.從圖6中可以看出，酪氨酸殘基（Δλ=15 nm）（圖6a）和色氨酸殘基（Δλ=60 nm）（圖6b），隨著頭孢曲松鈉濃度的增加，最大發(fā)射波長(zhǎng)均緩慢地紅移，熒光強(qiáng)度均逐漸減弱.表明，頭孢曲松鈉與胃蛋白酶發(fā)生作用時(shí)，影響色氨酸殘基和酪氨酸殘基的微環(huán)境，使色氨酸、酪氨酸殘基周圍的極性增加，疏水性減小，構(gòu)象發(fā)生改變.

圖6 頭孢曲松鈉與胃蛋白酶體系的同步熒光光譜Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of pepsin with CSI

3 結(jié)論

胃蛋白酶和頭孢曲松鈉結(jié)合使胃蛋白酶內(nèi)源熒光發(fā)生有規(guī)律的猝滅，猝滅機(jī)理為動(dòng)態(tài)猝滅，作用過程中兩者發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移，形成復(fù)合物，結(jié)合常數(shù)較大.頭孢曲松鈉和胃蛋白酶之間主要由疏水作用力相結(jié)合，且只有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)數(shù).本文取得的結(jié)果對(duì)藥學(xué)和臨床醫(yī)藥的生物學(xué)具有較大意義.

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