黎金鳳 林安華 鄧 穎 霍亞南 劉精東 吳明斌 王晨秀

SDF-1對糖尿病外周血EPCs功能的影響及其與PI3K/ AKT信號通路的關(guān)系

黎金鳳 林安華 鄧 穎 霍亞南△劉精東 吳明斌 王晨秀

目的 觀察基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）對糖尿病外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）功能的影響，探討SDF-1對EPCs的影響是否與PI3K/AKT信號通路有關(guān)。方法采集糖尿病患者（DM組）和健康對照者（HC組）外周血30 mL，提取并培養(yǎng)EPCs。（1）SDF-1干預(yù)組加入100 μg/L SDF-1培養(yǎng)液，非干預(yù)組加入EGM-2MV培養(yǎng)基，采用Boyden小室和體外血管生成試劑盒觀察EPCs的遷移和體外血管生成能力。（2）將培養(yǎng)的EPCs分為空白對照組、1 μg/L SDF-1組、10 μg/L SDF-1組、100 μg/L SDF-1組、單純AMD3100組及100 μg/L SDF-1+AMD3100組，通過Western blot法檢測各組EPCs中AKT蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果（1）無SDF-1干預(yù)時(shí)，DM組EPCs遷移和血管形成能力低于HC組，SDF-1干預(yù)后，2組的EPCs遷移和血管形成能力均較干預(yù)前增強(qiáng)，但DM組增強(qiáng)的幅度高于HC組。（2）同一濃度下，DM組的AKT蛋白表達(dá)水平均低于HC組（均P＜0.01）。無論是DM組還是HC組，AKT蛋白的表達(dá)均隨著加入SDF-1濃度的增加而呈遞增趨勢（P＜0.05）；100 μg/L SDF-1+AMD3100組AKT蛋白的表達(dá)水平較100 μg/L SDF-1組明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論SDF-1可增強(qiáng)外周血EPCs遷移和血管形成能力，對糖尿病患者效果更為明顯，且SDF-1對EPCs的影響與PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1；內(nèi)皮祖細(xì)胞；PI3K/AKT；糖尿病

外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells, EPCs）在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生中起重要作用，它不僅參與血管新生過程，也參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷后修復(fù)[1-2]。利用EPCs的血管新生能力治療糖尿病缺血性疾病已成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1,SDF-1）呈劑量依賴性地促進(jìn)EPCs增殖，并顯著增強(qiáng)EPCs的克隆能力[3]，然而其具體機(jī)制不明，有研究顯示，SDF-1干預(yù)健康成人外周血EPCs，能夠呈時(shí)間-濃度依賴性地促使絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKT，又稱蛋白激酶B）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）蛋白的磷酸化[4]。本研究旨在觀察SDF-1對糖尿病患者外周血EPCs遷移能力、血管形成能力的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，以期為EPCs應(yīng)用于臨床治療糖尿病血管并發(fā)癥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人SDF-1購自PeproTech公司；EGM-2MV培養(yǎng)基購自lonza公司；DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-acLDL)購自Molecular Probe公司；FITC標(biāo)記荊豆凝集素(FITC-UEA-1)購自美國Sigma公司；Boyden小室購自江蘇海門麒麟公司；體外血管生成試劑盒ECM625購自Chemicon公司；AKT兔抗人抗體、β-actin鼠單克隆抗體購自Anbo公司；蛋白Marker、辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Earthox公司；AMD3100（CXCR4趨化因子受體拮抗劑）購自Sigma公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；uper Signal West Pico試驗(yàn)試劑盒購自Thermo公司。

1.2 研究對象 選取在我科住院的糖尿病患者15例（DM組）及在體檢中心健康體檢者15例（HC組），于2組中各選取10例用于EPCs遷移和血管形成能力的檢測，余下各5例用于檢測EPCs中AKT蛋白的表達(dá)水平。所有入選對象年齡40～50歲，均排除合并高血壓、血液系統(tǒng)疾病、近期手術(shù)、感染、外傷等情況以及服用雌激素、他汀類藥物、噻唑烷二酮類、中藥等可能影響EPCs的藥物。糖尿病患者符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，且排除有糖尿病并發(fā)癥的患者。研究獲江西省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 EPCs的培養(yǎng) 取受試者空腹外周靜脈血30 mL，用密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，將其接種在包被有人纖維連接蛋白（HFN）的6孔培養(yǎng)板中，在EGM-2MV培養(yǎng)基(含5％胎牛血清)中培養(yǎng)4 d后換液，3孔中加入100 μg/L SDF-1培養(yǎng)基(SDF-1干預(yù)組)，另外3孔加入EGM-2MV培養(yǎng)基(非干預(yù)組)。

1.3.2 EPCs的鑒定 將細(xì)胞與DiI-ac LDL(2.4 mg/L)37℃孵育1 h，以PBS洗3次后，用2％多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。固定后，用PBS浸洗，加入FITC-UEA-1(10 mg/L)，37℃繼續(xù)孵育1 h，激光共聚焦顯微鏡鑒定LDL和UEA雙染色陽性的細(xì)胞為正在分化的EPCs。

1.3.3 EPCs的遷移能力檢測 采用Boyden小室檢測EPCs趨化遷移能力，收集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)，對于非干預(yù)組，Boyden小室的下室僅加入20 μL（50 μg/L）血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），對于SDF-1干預(yù)組，在非干預(yù)組的基礎(chǔ)上加入100 μL（100 μg/L）的SDF-1。將2×105/mL EPC懸浮在100 mL培養(yǎng)液注入上室，37℃5％CO2孵箱孵育過夜，取出微孔濾膜，經(jīng)過漂洗、固定、染色、二甲苯透明，任意選取3個(gè)視野于100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞。

1.3.4 EPCs的體外血管生成能力檢測 采用體外血管形成試劑盒檢測EPCs的血管生成能力，將900 μL ECMatrixTM膠液與100 μL ECM 10×稀釋液混勻，加入96孔培養(yǎng)板（50 μL/孔），37℃孵育1 h成膠，每孔加入150 μL含細(xì)胞的培養(yǎng)液接種于聚合的ECMatrixTM膠的表面，37℃孵育24 h，在40倍倒置顯微鏡下觀察小血管的形成。

1.3.5 Western Blot檢測AKT蛋白 EPCs的分離、培養(yǎng)如前，細(xì)胞培養(yǎng)至第4天換液，6孔依次為空白對照組、1 μg/L SDF-1組、10 μg/L SDF-1組、100 μg/L SDF-1組、單純AMD3100組及100 μg/L SDF-1+AMD3100組。培養(yǎng)至第7天，收集各組貼壁的EPCs，提取蛋白質(zhì)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，p-AKT（Ser473）一抗4℃孵育過夜，二抗孵育1 h，進(jìn)行后續(xù)發(fā)光、壓片、顯影、定影等。β-actin為內(nèi)參。X線片掃描成像后，經(jīng)ImageJ 1.410圖像分析軟件對圖中印跡區(qū)帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 EPCs形態(tài)學(xué)觀察 從外周血剛分離獲得的EPCs大部分呈小圓形，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞數(shù)目開始增加，形態(tài)亦開始增大，第3天可見細(xì)胞集落形成（集落呈發(fā)芽式向外生長，中央為圓形細(xì)胞，周圍為梭形細(xì)胞），見圖1。第4天有較廣泛的細(xì)胞變形（以梭形細(xì)胞為主），以后梭形細(xì)胞逐漸增多；第7天可見典型的長梭形細(xì)胞，見圖2。細(xì)胞培養(yǎng)2周后，梭形細(xì)胞開始消失，取而代之的出現(xiàn)的是橢圓形細(xì)胞，呈鋪路石樣形態(tài)，見圖3。

2.2 EPCs的鑒定 EPCs培養(yǎng)4 d后通過激光共聚焦顯微鏡鑒定，細(xì)胞攝取DiI-ac LDL（紅色，激發(fā)波長543 nm）和結(jié)合FITC-UEA-1(綠色，激發(fā)波長477 nm)，DiI-ac LDL和FITC-UEA-1雙染色陽性細(xì)胞（呈黃色）被認(rèn)為是正在分化的EPCs，見圖4。

2.3 SDF-1對EPCs遷移能力的影響 無SDF-1干預(yù)時(shí)，DM組EPCs遷移能力低于HC組（P＜0.05）；SDF-1干預(yù)后，2組的EPCs遷移能力均較干預(yù)前增強(qiáng)，但DM組增強(qiáng)的幅度高于HC組（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of effects of SDF-1 on the migration ability of EPCs表1 SDF-1對EPCs遷移能力影響的比較 （個(gè)，±s）

Tab.1 Comparison of effects of SDF-1 on the migration ability of EPCs表1 SDF-1對EPCs遷移能力影響的比較 （個(gè)，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別DM組HC組t n 遷移EPCs數(shù)t 10 10非干預(yù)15.00±1.33 20.40±2.63 5.131＊SDF-1干預(yù)19.50±1.08 24.20±2.20 5.360＊16.745＊＊8.143＊＊SDF-1干預(yù)－非干預(yù)4.50±0.85 3.80±1.48 4.506＊

2.4 SDF-1對EPCs血管形成能力的影響 無SDF-1干預(yù)時(shí)，DM組EPCs血管形成能力低于HC組（P＜0.01）；SDF-1干預(yù)后，2組的EPCs血管形成能力均較干預(yù)前增強(qiáng)，但DM組增強(qiáng)的幅度高于HC組（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Effects of SDF-1 on angiogenesis ability of EPCs表2 SDF-1對EPCs血管形成能力的影響（μm，±s）

Tab.2 Effects of SDF-1 on angiogenesis ability of EPCs表2 SDF-1對EPCs血管形成能力的影響（μm，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別DM組HC組t n EPCs血管形成長度非干預(yù)116.99±7.98 184.24±7.44 19.490＊＊SDF-1干預(yù)138.02±9.65 198.88±8.99 14.586＊＊t 10 10 8.386＊＊5.477＊SDF-1干預(yù)—非干預(yù)21.03±12.14 14.64±5.52 6.825＊

2.5 不同濃度的SDF-1干預(yù)對EPCs中AKT蛋白表達(dá)的影響 同一濃度下，DM組的AKT蛋白表達(dá)水平均低于HC組（均P＜0.01）。無論是DM組還是HC組，AKT蛋白的表達(dá)均隨著加入SDF-1濃度的增加而呈遞增趨勢（P＜0.05）；100 μg/L SDF-1+ AMD3100組 AKT蛋白的表達(dá)水平較 100 μg/L SDF-1組明顯降低（P＜0.05），見圖5、表3。

Fig.5 AKT protein expressions under different concentrations of SDF-1 in two groups圖5 不同濃度SDF-1干預(yù)2組人群EPCs中AKT蛋白表達(dá)水平

Tab.3 AKT protein expressions under different concentrations of SDF-1 in two groups表3 不同濃度SDF-1干預(yù)2組人群EPCs中AKT蛋白表達(dá)水平 （n=5，±s）

Tab.3 AKT protein expressions under different concentrations of SDF-1 in two groups表3 不同濃度SDF-1干預(yù)2組人群EPCs中AKT蛋白表達(dá)水平 （n=5，±s）

＊＊P＜0.01;a與(1)比較，b與(2)比較，c與(3)比較，d與(4)比較，P＜0.05

組別空白對照組(1) 1 μg/L SDF-1組(2) 10 μg/L SDF-1組(3) 100 μg/L SDF-1組(4)單純AMD3100組(5) 100 μg/L SDF-1+ AMD3100組(6) F DM組0.706±0.009 0.744±0.009a0.788±0.005ab0.845±0.009abc0.628±0.006a0.526±0.016ad725.603＊＊HC組0.833±0.006 0.842±0.004 0.869±0.004ab0.898±0.007abc0.742±0.010a0.638±0.016ad574.847＊＊t 24.699＊＊22.933＊＊27.761＊＊10.982＊＊21.630＊＊11.124＊＊

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者外周血中EPCs數(shù)量較健康人明顯減少，且EPCs數(shù)量減少與糖化血紅蛋白（HbA1c）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）呈負(fù)相關(guān)，提示高血糖、高LDL-C均可導(dǎo)致EPCs數(shù)量的減少[5]。劉華偉等[6]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病危險(xiǎn)因素的存在與EPCs數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，說明糖尿病在該特殊群體中對EPCs的影響。王麗莉等[7]研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者EPCs數(shù)量下降，且高齡、血糖控制差及有血管病變的患者EPCs數(shù)量下降更為明顯。因此，早期治療、嚴(yán)格控制血糖、血脂有利于增加糖尿病患者體內(nèi)的EPCs并改善其功能，進(jìn)而促進(jìn)糖尿病血管病變的恢復(fù)。

Hamed等[8]通過對55例糖尿病合并心血管病患者的研究發(fā)現(xiàn)，高血糖和高LDL-C能夠降低CXCR4基因表達(dá)并抑制PI3K/AKT/eNOS信號級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的活化，從而抑制EPCs的遷移。本研究結(jié)果亦證實(shí)，糖尿病患者EPCs遷移能力和血管形成能力較健康成人明顯減弱，加入SDF-1干預(yù)后，EPCs遷移能力和血管形成能力均增強(qiáng)，且DM組的EPCs遷移能力和血管形成能力增強(qiáng)的幅度均高于HC組。由此推測，SDF-1能促進(jìn)EPCs遷移能力和血管形成能力，對于EPCs功能受損的糖尿病患者效果更為明顯。

SDF-1是細(xì)胞膜CXC趨化因子家族一員，它與EPCs受體CXCR4結(jié)合，激活的SDF-1/CXCR4軸進(jìn)而動員骨髓的EPCs進(jìn)入血液循環(huán)和誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移。但其激活機(jī)制涉及多種信號分子途徑，包括蛋白酶的激活、細(xì)胞因子的釋放和基質(zhì)的降解[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1α干預(yù)EPCs，能夠呈時(shí)間-濃度依賴性促使AKT、eNOS和ERK1/2蛋白的磷酸化，從而激活PI3K/AKT/eNOS信號通路[4]。本研究結(jié)果顯示：糖尿病患者AKT蛋白表達(dá)水平較健康對照者明顯降低，可能與糖尿病狀態(tài)下EPCs數(shù)量下降、功能受損有關(guān)。且AKT蛋白的表達(dá)在1、10、100 μg/L SDF-1組呈遞增趨勢；100 μg/L SDF-1+AMD3100 組AKT蛋白的表達(dá)較100 μg/L SDF-1組明顯降低，筆者推測，SDF-1呈濃度依賴性上調(diào)EPCs中p-AKT-Ser473的表達(dá)，而SDF-1受體CXCR4拮抗劑AMD3100可以明顯阻斷SDF-1上調(diào)p-AKT-Ser473的作用，提示SDF-1通過PI3K激活了EPCs中AKT信號通路。本研究結(jié)果中，單純AMD3100組AKT蛋白的表達(dá)較空白對照組低，分析可能與AMD3100阻斷EPCs自身表達(dá)的SDF-1α的自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)，增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體內(nèi)SDF-1有明顯升高，而有黃斑水腫者SDF-1濃度更高，同時(shí)通過動物模型實(shí)驗(yàn)表明采取玻璃體腔內(nèi)注射外源性的SDF-1能明顯地促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管生成，而注射SDF-1中和抗體則可阻止新生血管形成[10]。本研究中也觀察到，AMD3100可阻滯PI3K/ AKT信號通路，在糖尿病增殖性視網(wǎng)膜病變的患者中，是否可局部應(yīng)用SDF-1拮抗劑來阻止脈絡(luò)膜新生血管的形成，從而為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變、黃斑水腫提供一個(gè)安全有效的治療方法，值得探討。對于糖尿病缺血性血管病變患者，是否有望通過局部注射人SDF-1改善血供，是有待探索的新方向。

Fig.1 Colony formation after three days（×20）圖1 第3天集落形成（×20）

Fig.2 Cells showing long fusiform after seven days（×10）圖2 第7天細(xì)胞呈長梭形（×10）

Fig.3 Cells showing“cobblestone”appearance after two weeks（×10）圖3 第14天細(xì)胞呈鋪路石樣形態(tài)（×10）

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（2014-06-03收稿 2014-07-04修回）

（本文編輯 閆娟）

Effects of Stromal Cell-Derived-Factor-1 on Endothelial Progenitor Cells of Peripheral Blood and Their Relationship with PI3K/AKT Signal Transduction Pathway in Patients with Diabetes

LI Jinfeng,LIN Anhua,DENG Ying,HUO Ya’nanΔ,LIU Jingdong,WU Mingbin,WANG Chenxiu
Department of Endocrinology,The People's Hospital in Jiangxi Province,Nanchang 330006,China△

E-mail：hyn_hyn0216@126.com

ObjectiveTo observe the effects of stromal cell-derived-factor-1(SDF-1)on the function of endothelial progenitor cells（EPCs）of peripheral blood in patients with diabetes,and to discuss the effects of PI3K/AKT signaling pathway on the role of SDF-1 in EPCs.MethodsThe peripheral blood samples(30 mL)were collected in 10 diabetes patients (DM group)and 10 healthy controls(HC group).(1)The 100 μg/L SDF-1 was added in intervention group.EGM-2MV was added in non-intervention group.The Boyden chamber and in vitro angiogenesis kit were used to analyze the migration and in vitro angiogenesis of EPCs.(2)Cultured EPCs were divided into blank control group,1 μg/L SDF-1 group,10 μg/L SDF-1 group,100 μg/L SDF-1 group,pure AMD3100 group and 100 μg/L SDF-1+AMD3100 group.AKT protein expression levels of endothelial progenitor cells were detected by Western blot assay in each group.Results(1)Without intervention with SDF-1,EPCs’migration and angiogenesis ability were lower in DM group than those in HC group.After intervention with SDF-1,the migration and angiogenesis ability were enhanced in two groups,but the increased level was higher in DM group than that of HC group.(2)Under the same concentration,AKT protein expression level was significantly lower in DM group than that in HC group(P＜0.01).AKT protein expression levels were increased with the increased levels of SDF-1 in DM group and HC group(P＜0.05).AKT protein expression was significantly lower in 100 μg/L SDF-1+AMD3100 group than that of 100 μg/L SDF-1 group(P＜0.05).ConclusionSDF-1 can increase the chemotactic migration and angiogenesis ability of EPCs in peripheral blood,especially for patients with diabetes.The effects of SDF-1 on EPCs were related to the PI3K/AKT signaling pathway.

stromal cell-derived-factor-1;endothelial progenitor cells;phosphoinositide3-kinase/protein kinase B; diabetes

R587.1

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.004

江西省科技廳科技支撐計(jì)劃（20111BBG70018-1）

南昌，江西省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（郵編330006）

△通訊作者 E-mail：hyn_hyn0216@126.com