鄭紅，韓景田，丁媛媛，楊帆

（濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003）

殼聚糖修飾磁性納米粒子對(duì)BSA的吸附性能

鄭紅，韓景田，丁媛媛，楊帆

（濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003）

采用化學(xué)共沉淀法制備磁性Fe3O4納米粒子，以（3-氯丙基）三甲氧基硅烷為偶聯(lián)劑將殼聚糖共價(jià)鍵合到磁性Fe3O4納米粒子的表面，通過(guò)紅外光譜（FTIR）、X射線衍射（XRD）、掃描電子顯微鏡（SEM）及熱重分析（TGA）對(duì)其進(jìn)行了表征。主要研究了不同影響因素（吸附時(shí)間、pH值、牛血清白蛋白濃度）下殼聚糖修飾的磁性納米粒子對(duì)牛血清白蛋白（BSA）的吸附性能。結(jié)果得到殼聚糖修飾的磁性Fe3O4納米粒子粒徑為20 nm左右，殼聚糖在磁性Fe3O4納米粒子表面的接枝率為15.40%。研究表明：在不同條件下，與未修飾的磁性Fe3O4納米粒子相比，經(jīng)殼聚糖修飾的Fe3O4納米粒子對(duì)BSA均表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附能力。

納米粒子；表面；牛血清白蛋白；殼聚糖；蛋白質(zhì)

磁性納米材料具有一定的磁響應(yīng)性，在外加磁場(chǎng)的作用下可迅速地發(fā)生定向移動(dòng)，因而在生物磁分離、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[1-2]。殼聚糖（Chitosan）具有良好的生物活性、生物相容性和生物可降解性[3]，在化工、環(huán)保、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越引起人們的關(guān)注，但由于殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量大，且分子間和分子內(nèi)部存在大量的氫鍵，因此不溶于水等一些普通溶劑，其應(yīng)用受到很大限制。但經(jīng)過(guò)解聚后所得到的相對(duì)分子質(zhì)量低于一萬(wàn)的低聚殼聚糖有較高的溶解度，易被吸收利用，展現(xiàn)出獨(dú)特的生理活性和功能，即在人體腸道內(nèi)活化增殖雙歧桿菌，提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，降低血壓、血糖、血脂，吸附膽固醇等，因此，殼聚糖被廣泛用于固定化酶 、控緩釋藥物[4]等領(lǐng)域。采用低聚殼聚糖修飾的磁性Fe3O4納米粒子兼具了殼聚糖和磁性Fe3O4納米粒子的雙重特性，一方面可對(duì)外加磁場(chǎng)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的磁響應(yīng)性，易于磁場(chǎng)分離；另一方面可通過(guò)其游離的—NH2共價(jià)鍵合活性物質(zhì)[5]。經(jīng)過(guò)修飾改性后的磁性納米材料在生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域展現(xiàn)出其強(qiáng)大的生命力。研究蛋白質(zhì)的界面吸附行為，一方面對(duì)于考察材料的生物相容性具有重要的作用；另一方面，對(duì)磁性納米藥物載體與蛋白質(zhì)相互作用的研究，有助于了解其在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布情況，對(duì)闡明藥物的作用機(jī)制、藥物代謝、動(dòng)力學(xué)和藥物的毒副作用及開發(fā)新藥物等具有重要的意義。前期的研究工作多通過(guò)庫(kù)侖引力將殼聚糖吸附在磁性納米粒子表面以實(shí)現(xiàn)對(duì)納米粒子的表面修飾，然而物理吸附在納米粒子表面的殼聚糖分子的穩(wěn)定性較差，與其他生物大分子發(fā)生吸附競(jìng)爭(zhēng)而易脫落。作者曾利用葡萄糖酸對(duì)磁性Fe3O4納米粒子進(jìn)行表面修飾，并對(duì)該納米粒子在固定化脂肪酶的應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)行了研究[6]。本工作采用共沉淀法制備了磁性Fe3O4納米粒子，以（3-氯丙基）三甲氧基硅烷為偶聯(lián)劑，將低聚殼聚糖分子共價(jià)鍵合到磁性納米粒子表面，制備了分散性良好，穩(wěn)定性強(qiáng)的磁性Fe3O4-殼聚糖納米粒子。對(duì)納米粒子的組成、界面特性及形貌進(jìn)行了表征，并研究了該納米粒子對(duì)牛血清白蛋白的吸附性能，為殼聚糖修飾的磁性納米粒子在醫(yī)藥及生物吸附等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖，2000～5000 Da， 脫乙酰度DAC≥85嘉興科瑞生物科技有限公司；FeCl3·6H2O，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；FeSO4·7H2O，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；（3-氯丙基）三甲氧基硅烷，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白BSA，生工生物工程有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，生興生物技術(shù)（南京）有限公司；其他所用化學(xué)試劑均為分析純。

TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，EL20 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電子天平，EL204 梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海逸龍科技有限公司；JJ-1精密定時(shí)電動(dòng)攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Fe3O4納米粒子的制備

精確稱取2.7029 g FeCl3·6H2O和1.3901 g FeSO4·7H2O （摩爾比Fe3+∶Fe2+為2∶1）放入250 mL雙頸圓底燒瓶中，加入10 mL 0.6 mol/L鹽酸溶液，待充分溶解后，迅速加入50 mL NaOH溶液（1.5 mol/L），N2保護(hù)下常溫機(jī)械攪拌30 min，放入70 ℃恒溫水浴中孵育2 h。用去離子水和無(wú)水乙醇分別超聲洗滌3次，真空干燥得磁性Fe3O4粉末[6]。

1.2.2 Fe3O4納米粒子表面修飾

將上述制得的磁性Fe3O4粉末放入250 mL四頸燒瓶中，加入100 mL甲苯，超聲使其充分分散，加入4.0 mL（3-氯丙基）三甲氧基硅烷，N2保護(hù)下加熱回流10 h。產(chǎn)物用二甲基亞砜和丙酮分別洗滌3次，真空干燥。

將0.5 g上述含（3-氯丙基）三甲氧基硅烷偶聯(lián)劑的Fe3O4樣品加入到100 mL殼聚糖溶液中（2%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)），在強(qiáng)烈攪拌下加熱回流8 h。用無(wú)水乙醇洗滌3遍，60 ℃真空干燥過(guò)夜。

1.2.3 表面改性的Fe3O4納米粒子對(duì)BSA的吸附[7]

（1）BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取含BSA為5 μg、10 μg、15 μg、20 μg、25 μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL，分別加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻放置5 min，以蒸餾水為空白，測(cè)定595 nm處吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，BSA濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由公式Abs=K1×(C)＋K0得到線性回歸方程：Y=0.05211X-0.01611（R2=0.9978）。

（2）BSA初始濃度對(duì)吸附的影響 取二組初始濃度為0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL、0.12 mg/mL、0.14 mg/mL 的BSA溶液各1.0 mL，分別加入2.0 mg/mL 殼聚糖修飾與未修飾的Fe3O4納米粒子的樣品懸液各1.0 mL，37 ℃超聲1 h，離心分離（15000 r/min），取上清液測(cè)定BSA含量。

（3）時(shí)間對(duì)BSA吸附的影響 恒定BSA溶液初始濃度為0.1 mg/mL變化超聲時(shí)間分別為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，操作同上。

（4）pH值對(duì)BSA吸附的影響 恒定BSA初始濃度為0.1 mg/mL，溫度為37 ℃，吸附時(shí)間1 h，用磷酸-檸檬酸緩沖液（10 mmol/L）控制溶液pH值分別為2.2、3.4、5.6、7.4、8.0，考察pH值對(duì)BSA吸附的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁性納米粒子的表征

圖1為殼聚糖修飾的磁性Fe3O4納米粒子的紅外光譜圖。對(duì)其解析如下，579 cm-1的寬吸收峰是Fe—O的特征吸收峰，1060 cm-1是C—O—C伸縮振動(dòng)峰，1630 cm-1為FeOO-伸縮振動(dòng)峰，2922 cm-1是—NH的伸縮振動(dòng)吸收峰，3429 cm-1是Fe3O4粒子表面羥基—OH的伸縮振動(dòng)峰，同時(shí)，在700 cm-1附近無(wú)亞鐵氧鍵的特征吸收峰，說(shuō)明樣品為純相。以上分析說(shuō)明殼聚糖已共價(jià)結(jié)合到磁性Fe3O4納米粒子上。

圖2為殼聚糖修飾的磁性Fe3O4納米粒子的XRD譜圖。通過(guò)與Fe3O4的標(biāo)準(zhǔn)XRD譜圖比較，在30.18°、35.62°、43.40°、53.86°、56.80°和62.74°左右出現(xiàn)了Fe3O4的6個(gè)特征衍射峰，且主要衍射峰較尖銳，表明樣品為純的單一相反尖晶石型Fe3O4，且殼聚糖的修飾未引起Fe3O4晶相的變化[10-11]。

圖3為殼聚糖修飾(a)和未修飾(b)的磁性Fe3O4納米粒子的SEM圖像。如圖3所示，殼聚糖修飾前后納米粒子的粒徑變化不大，未經(jīng)修飾的Fe3O4納米粒子(b)呈規(guī)則球形，顆粒尺寸較均一，團(tuán)聚現(xiàn)象較為嚴(yán)重；經(jīng)殼聚糖修飾后(a)的顆粒形狀較規(guī)則，呈球形，平均粒徑為20 nm左右，分散較未修飾的Fe3O4納米粒子均勻，團(tuán)聚現(xiàn)象有所改善。這可能是由于包覆在Fe3O4粒子表面的殼聚糖起到分散劑和穩(wěn)定劑的作用，降低了磁性粒子的表面自由能，同時(shí)降低了磁性粒子之間的靜電引力，改善了納米粒子在介質(zhì)中的分散狀況。

圖1 殼聚糖修飾后的Fe3O4紅外圖譜

圖2 殼聚糖修飾后的Fe3O4XRD圖譜

圖3 殼聚糖修飾后的Fe3O4和未修飾的Fe3O4的SEM照片

圖4為殼聚糖修飾的磁性Fe3O4納米粒子的TGA曲線。如圖4所示，由于樣品干燥完全，沒有出現(xiàn)因脫水導(dǎo)致樣品質(zhì)量快速減少的現(xiàn)象；當(dāng)溫度達(dá)到150 ℃時(shí)，樣品開始失重，當(dāng)達(dá)到250 ℃左右時(shí)，樣品質(zhì)量減輕最為迅速，此時(shí)共價(jià)結(jié)合到磁性Fe3O4納米粒子上的殼聚糖迅速分解，單位時(shí)間內(nèi)分解量達(dá)到最大，隨溫度的不斷升高，結(jié)合到磁性Fe3O4納米粒子上的有機(jī)物質(zhì)逐漸分解，而Fe3O4納米粒子在N2保護(hù)下不會(huì)分解，熱重分析顯示質(zhì)量損失約占15.40%，從而得出殼聚糖在磁性Fe3O4納米粒子表面的接枝率為15.40%。

圖4 殼聚糖修飾后的Fe3O4的熱重曲線

2.2 表面改性的Fe3O4納米粒子與BSA的吸附性能

2.2.1 時(shí)間對(duì)吸附的影響

恒定其他實(shí)驗(yàn)條件，考察吸附時(shí)間對(duì)BSA吸附的影響如圖5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著吸附時(shí)間的增加，納米粒子對(duì)BSA吸附的量也隨之增加，而后趨于平緩，經(jīng)殼聚糖修飾的Fe3O4納米粒子表現(xiàn)出更強(qiáng)的BSA吸附能力。

2.2.2 BSA初始濃度對(duì)吸附的影響

初始BSA濃度對(duì)吸附的影響如圖6所示，隨著牛血清白蛋白BSA初始濃度增加，納米粒子對(duì)BSA吸附也隨之增加，在BSA初始濃度相同的條件下，與未修飾Fe3O4納米粒子相比，經(jīng)殼聚糖修飾的磁性Fe3O4納米粒子對(duì)BSA具有更強(qiáng)的吸附能力。

2.2.3 pH值對(duì)吸附的影響

由圖7可見，納米粒子對(duì)BSA吸附隨pH值增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在pH=3.4時(shí)達(dá)到峰值。與未修飾的Fe3O4納米粒子相比，相同pH值條件下，經(jīng)殼聚糖修飾的Fe3O4納米粒子具有更強(qiáng)的BSA吸附能力。這可能是由于殼聚糖分子中含有大量游離氨基（—NH2），經(jīng)殼聚糖修飾的磁性Fe3O4納米粒子表面帶有一定數(shù)量的正電荷，而未修飾的磁性Fe3O4納米粒子帶有負(fù)電荷。一般情況下，牛血清白蛋白（BSA）的等電點(diǎn)（pI）在4.8左右[12]，當(dāng)pH＞pI時(shí)，BSA表面帶有負(fù)電荷，反之，pH＜pI時(shí)，BSA帶正電荷。在pH=7.4時(shí)，帶有負(fù)電荷的BSA與帶部分正電荷的殼聚糖修飾的磁性Fe3O4納米粒子發(fā)生靜電吸引所致[7]。

圖5 時(shí)間對(duì)BSA吸附的影響

圖6 BSA初始濃度對(duì)吸附的影響

圖7 pH值對(duì)BSA吸附的影響

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用（3-氯丙基）三甲氧基硅烷為偶聯(lián)劑將低聚殼聚糖共價(jià)結(jié)合到磁性Fe3O4納米粒子的表面，制備了粒徑為20 nm左右、形狀較均勻、分散性較好的磁性納米粒子，殼聚糖在磁性Fe3O4納米粒子表面的接枝率達(dá)15.40%。經(jīng)殼聚糖修飾的磁性Fe3O4納米粒子對(duì)BSA具有更強(qiáng)的吸附能力，這可能與修飾前后磁性Fe3O4納米粒子與BSA分子間的靜電作用力有關(guān)，但仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。明確納米粒子與蛋白質(zhì)分子之間相互作用的方式及原理為該類納米材料在生物醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

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Adsorption of bovine serum albumin on chitosan modified magnetic nanoparticles

ZHENG Hong，HAN Jingtian，DING Yuanyuan，YANG Fan
（School of Pharmacy，Binzhou Medical College，Yantai 264003，Shandong，China）

Chitosan was grafted onto the surface of Fe3O4magnetic nanoparticles fabricated by a chemical coprecipitation method by using (3-chloropropyl) trimethoxysilane as a coupling agent. The modified magnetic nanoparticles were characterized by infrared spectroscopy (FTIR)，X-ray diffraction (XRD)，scanning electron microscopy (SEM) and thermal gravimetric analysis (TGA). The adsorption properties of the magnetic nano-adsorbent for BSA were investigated under different conditions，including adsorption time，pH and concentration of bovine serum albumin. The size of nanoparticles was about 20 nm，and chitosan made up 15.40% of the weight of the modified Fe3O4magnetic nanoparticles. Compared with Fe3O4nanoparticles，chitosan modified nanoparticles showed higher BSA adsorption capacity.

nanoparticles；surface；bovine serum albumin；chitosan；protein

TB 34；Q 819

A

1000-6613（2014）01-0174-05

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.01.030

2013-07-09；修改稿日期：2013-08-08。

山東科技發(fā)展計(jì)劃（2011YD21006）及濱州醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金（511094）項(xiàng)目。

鄭紅（1986—），女，碩士研究生。聯(lián)系人：韓景田，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事靶向、控釋納米載藥體系的研制及生物學(xué)效應(yīng)研究。E-mail hanjingtian002@163.com。