薛 瑞，章 激，張玉潔，李 燦

（湖北文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441021）

參麥注射液對(duì)荷H22小鼠免疫功能的影響

薛 瑞，章 激，張玉潔，李 燦

（湖北文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441021）

目的 研究參麥注射液對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響。方法 建立 H22細(xì)胞小鼠移植瘤模型，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為模型組（荷瘤空白組），參麥注射液三個(gè)劑量組，另設(shè)空白參考組，每日灌胃給藥，通過測(cè)定對(duì)白細(xì)胞總數(shù)及分類，sIL-2R、IL-2、IL-4含量，脾淋巴細(xì)胞增殖及遲發(fā)超敏反應(yīng)能力的影響，探討參麥注射液的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果 參麥注射液可提高荷瘤小鼠白細(xì)胞總數(shù)；降低荷瘤小鼠血清 sIL-2R的含量，提高 IL-2，IL-4水平，改善小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和遲發(fā)型超敏反應(yīng)能力。結(jié)論

參麥注射液具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。

參麥注射液；H22；白細(xì)胞；sIL-2R；IL-2；IL-4；脾淋巴細(xì)胞增殖；遲發(fā)超敏反應(yīng)

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，其發(fā)病率逐年上升。目前治療腫瘤的常用有效手段為放療及化療，但由于其細(xì)胞毒作用，常引起機(jī)體免疫能力下降［1-2］。因此尋找安全有效的抗腫瘤藥物具有重要意義。參麥注射液具有益氣固精，養(yǎng)陰生津等功效。方中人參益氣、固脫生津、養(yǎng)心；麥冬定肺氣、安五臟，兩藥配伍益氣固脫，養(yǎng)陰生津［3］。臨床上參麥注射液與化療藥物聯(lián)用可扶正培本，改善氣陰兩虛和脾胃失和證候等。本實(shí)驗(yàn)擬觀察參麥注射液對(duì)荷H22小鼠外周白細(xì)胞總數(shù)、sIL-2R、IL-2，IL-4含量，脾淋巴細(xì)胞增殖及遲發(fā)超敏反應(yīng)能力的影響來探討其對(duì)小鼠免疫功能的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物與儀器 ICR小鼠 60只，SPF級(jí)，體重18～20 g，雌雄兼用，由襄陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。合格證號(hào)：襄醫(yī)動(dòng)字第2001001號(hào)。雅培血細(xì)胞分析儀，美國雅培 -1700；電子天平AY-120，日本島津；Model 550型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，美國 BIO-RAD公司。

1.2 瘤株 H22細(xì)胞株，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供。

1.3 藥物與試劑 參麥注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1206235）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gbico公司）；美洲商陸（PMW）、刀豆蛋白A和MTT（Sigma公司）；可溶性白介素-2受體（sIL-2R）定量 EIA試劑盒（上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司）；IL-2和IL-4酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（GDB公司）；超純水為自制；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 荷 H22移植瘤小鼠模型的建立 傳代：取武漢同濟(jì)大學(xué)相關(guān)科研組已建的H22腹水瘤模型小鼠（已傳代至第8天）數(shù)只，頸椎脫臼處死，抽取腹水，滅菌 NS調(diào)瘤細(xì)胞數(shù)至 1×107·mL-1，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)為98%以上可用，取0.2 mL瘤細(xì)胞懸液接種于小鼠腹腔。按照此法體內(nèi)傳代 3次。接種：將接種6～8 d后腹水生長良好的小鼠頸椎脫臼處死，抽取腹水，用 NS稀釋。取 ICR小鼠 45只，雌雄兼用，（20±2）g。除空白參考組外，每鼠接種0.2 mL瘤細(xì)胞懸液于右腋窩皮下。

2.2 分組及給藥 分組：接種24 h后，取初步觀測(cè)認(rèn)定建模成功的小鼠 40只（后續(xù)試驗(yàn)中將給以檢驗(yàn)認(rèn)定），隨機(jī)分為以下4組，每組10只：

A1：模型組（荷瘤模型對(duì)照組）；A2：參麥20組（給參麥注射液20 mL·kg-1）；A3：參麥 40組（給參麥注射液40 mL·kg-1）；A4：參麥80組（給參麥注射液80 mL·kg-1）。

此外，建立A0：空白參考組，即未建立H22移植瘤模型的空白鼠 4只。

給藥：空白參考組和模型組均灌胃生理鹽水0.2 mL·d-1，連續(xù)灌胃7d；A2、A3及 A4等三個(gè)給藥組分別按照 20、40和 80 mL·kg-1·d-1灌胃。連續(xù)給藥7 d。

此外，取4只空白鼠作為A0：空白參考組。2.3 檢測(cè)小鼠血常規(guī) 末次給藥后 24 h，眶靜脈叢采血，檢測(cè)血常規(guī)中白細(xì)胞（WBC）、淋巴細(xì)胞（LY）、中性粒細(xì)胞（NEUT）、單核細(xì)胞（MONO）、嗜酸性粒細(xì)胞（EO）及嗜堿性粒細(xì)胞（BASO）的濃度。

2.4 檢測(cè)血清 sIL-2R的含量 末次給藥后 24 h，眶靜脈叢采血，收集血清，按試劑盒說明書用雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定 sIL-2R的含量。

2.5 檢測(cè)血清 IL-2，IL-4的含量 末次給藥后24 h，眶靜脈叢采血，收集血清，按試劑盒說明書采用 ELISA法測(cè)定 IL-2，IL-4的含量。

2.6 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采血后，頸椎脫臼處死小鼠，無菌分離小鼠的脾臟，常規(guī)制備脾淋巴細(xì)胞，RPMI 1640，體積分?jǐn)?shù)為 0.1的 FBS，5×10-5mol·L-12-巰基乙醇培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×109·L-1，接種于96孔板，加入終濃度為5 mg·L-1的PWM，常規(guī)培養(yǎng)70 h后，MTT法檢測(cè)各孔活細(xì)胞總數(shù)的情況，由以下公式計(jì)算刺激指數(shù)：

2.7 遲發(fā)型超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 給藥 d 2小鼠背部剃毛，在1×1 cm2范圍內(nèi)涂抹20 μL丙酮致敏，給藥d 5，各組小鼠右耳用0.08 mol·L-1DNFB丙酮20 μL進(jìn)行攻擊，48 h后頸椎脫臼處死小鼠，剪下雙耳，打孔稱重，以左右耳重量之差作為耳廓腫脹度。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，均通過正態(tài)性檢驗(yàn)。多組間的比較為單因素方差分析，各組間兩兩比較（多重比較）為 HSD-q檢驗(yàn)。顯著性水準(zhǔn) α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)免疫抑制小鼠血常規(guī)的影響 數(shù)據(jù)見表1。與空白參考組相比，模型組WBC總數(shù)明顯降低，分類結(jié)果顯示比例失調(diào)；與模型組相比，參麥三個(gè)劑量組的白細(xì)胞（WBC）、淋巴細(xì)胞（LY）均明顯增高（P＜0.05）；中性粒細(xì)胞（NEUT）絕對(duì)數(shù)（總數(shù)×比例）明顯較低（P＜0.05），符合外周血WBC等組成特點(diǎn)。各指標(biāo)具體的統(tǒng)計(jì)比較結(jié)果見表 1，不再逐一評(píng)價(jià)。

3.2 對(duì)荷瘤小鼠血清sIL-2R含量的影響 數(shù)據(jù)列示于表2。與空白參考組相比，荷瘤小鼠血清中sIL-2R含量明顯升高；參麥三個(gè)劑量組均可降低荷瘤小鼠血清中 sIL-2R含量。統(tǒng)計(jì)分析如下：

A1～A4等四個(gè)組整體比較（單因素方差分析）為有顯著性差異（P＜0.05）；各組兩兩多重比較（HSD-q檢驗(yàn)）：參麥各組與模型組相比，差異均為顯著（P＜0.05）；參麥各組間比較，也多有顯著性意義（P＜0.05）。

表 1 參麥對(duì)荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞的影響（Mean±Sd，n＝10）

表 2 參麥對(duì)荷瘤小鼠血清 sIL-2R、IL-2，IL-4含量的影響（Mean±Sd，n＝10）

3.3 對(duì)荷瘤小鼠血清 IL-2，IL-4含量的影響 數(shù)據(jù)仍見表2?？偟淖兓厔?shì)和前述 sIL-2R相反：即荷瘤小鼠血清IL-2，IL-4明顯低于空白參考組；參麥各劑量組尤其是高、中劑量組，其血清 IL-2，IL-4水平均明顯高于模型組。統(tǒng)計(jì)分析如下：

IL-2，IL-4這二指標(biāo)，A1～A4等四個(gè)組整體比較，差異均有顯著性意義（P＜0.05）；各組兩兩比較：參麥各組與模型組相比，參麥各組間比較，差異也多為顯著（P＜0.05）；詳見表2。

3.4 對(duì)荷瘤小鼠系統(tǒng)免疫功能的影響 數(shù)據(jù)見表3。由數(shù)據(jù)看出：與空白參考組相比，荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的體外增殖及其遲發(fā)型超敏反應(yīng)能力明顯降低；與模型組比較，參麥對(duì)PWM刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和遲發(fā)型超敏反應(yīng)能力有明顯改善作用。統(tǒng)計(jì)分析如下：

刺激指數(shù)及耳廓腫脹度這兩指標(biāo)，A1～A4等四個(gè)組整體比較，差異均有顯著性意義（P＜0.05）；各組兩兩比較：參麥各組與模型組相比，差異均為顯著；參麥各組間比較，部分為差異顯著（P＜0.05）；詳見表3。

表3 參麥對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響（Mean±Sd，n＝6）

4 討論

機(jī)體的免疫功能狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系，當(dāng)宿主免疫功能低下或者受到抑制時(shí)，腫瘤的發(fā)生率明顯增高，在腫瘤進(jìn)行性生長時(shí)腫瘤患者的免疫功能也受到抑制［4-5］。外周白細(xì)胞為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞；可溶性白細(xì)胞介素2受體（Solvable Interleukin-2 Receptor，sIL-2R）是一種重要的免疫抑制物［6］；IL-2是參與免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫作用［7］，sIL-2R可與 IL-2R競爭性結(jié)合 IL-2，從而抑制后者的抗腫瘤等生物學(xué)活性；IL-4是 B細(xì)胞活化的啟動(dòng)因子，可促進(jìn) B細(xì)胞增殖、成熟及分化產(chǎn)生 IgE，從而促進(jìn)體液免疫應(yīng)答。IL-4的免疫作用機(jī)制復(fù)雜，但它與其他白介素在體內(nèi)的含量比率應(yīng)趨于平衡狀態(tài)，過高或過低都提示免疫系統(tǒng)可能受到損傷［8-9］。

本實(shí)驗(yàn)觀察到參麥注射液可顯著升高荷瘤小鼠的白細(xì)胞總數(shù)，降低荷瘤小鼠血清sIL-2R的含量，顯著提高血清 IL-2，IL-4的水平，提示參麥注射液對(duì)荷 H22小鼠的免疫功能具有一定的改善和調(diào)節(jié)作用。

小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)是因 DNFB與小鼠腹壁皮膚蛋白結(jié)合可形成一種完全蛋白，并由此刺激 T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞，再用DNFB進(jìn)行抗原攻擊，致使局部腫脹，其腫脹的程度可以反應(yīng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)程度，屬細(xì)胞特異性免疫能力［10］。參麥注射液對(duì) PWM刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和遲發(fā)型超敏反應(yīng)能力有明顯改善作用。綜上提示參麥注射液對(duì)荷瘤小鼠的系統(tǒng)免疫狀態(tài)有改善和調(diào)節(jié)作用，這對(duì)惡性腫瘤等疾病的防治具有重要意義。

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Immunomodulatory effect of shenmai injection on mice with H22

XUE Rui，ZHANG Ji，ZHANG Yu-jie，et al
（Xiangyang Central Hospital Affiliated to Hubei University of Arts and Science，Xiangyang Hubei 441021，China）

Objective To study the immunomodulatory effect of shenmai injection on mice with H22.Methods After subcutaneous implantation of the H22 cells，the tumor-bearing mice were randomized into control group，three shenmai doses groups and normal control group.Those mice were given the different doses of shenmai.Immunity function of Shenmai was explored by determining its influence on leukocytes and classification，the serum content of sIL-2R，IL-2，IL-4，the spleen lymphocyte proliferation and delayed hypersensitivity thymus index.Results Shenmai injection significantly increased the white blood cells，IL-2 and IL-4，decreased the content of sIL-2R，promoted spleen lymphocyte proliferation and delayed hypersensitivity.Conclusion Shenmai injection modulates the immunity function on mice with H22.

shenmai injection；H22；leukocyte；sIL-2R；IL-2；IL-4；splenic lymphocyte proliferation；delayed hypersensitivity

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.05.008

2013-10-05，

2014-01-08）

章 激，男，副主任藥師，研究方向：腫瘤藥理，E-mail：22751520＠qq.com