梁峰，王莉，苑嬡，宋兆齊，劉秀花

(1.商丘師范學(xué)院生物精煉河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南商丘476000;2.商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南商丘476000)

光照和肌醇對(duì)木霉生長(zhǎng)和產(chǎn)脂能力影響

梁峰1，王莉2，苑嬡2，宋兆齊2，劉秀花2

(1.商丘師范學(xué)院生物精煉河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南商丘476000;2.商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南商丘476000)

木霉菌的許多種屬都能夠產(chǎn)生脂類物質(zhì)，并且已經(jīng)被用來(lái)研究脂類物質(zhì)的生產(chǎn).本研究主要探索光照和肌醇對(duì)木霉生物量積累和油脂量積累的作用.結(jié)果表明:與遮光處理組相比，正常光照培養(yǎng)條件更易于菌株成熟孢子的形成，并且正常光照培養(yǎng)也利于菌株L1生物量和油脂量的積累;肌醇的添加會(huì)促進(jìn)菌株生物量的積累，但是對(duì)菌株L1油脂量的積累有一定的抑制作用，對(duì)菌株L2，相比無(wú)肌醇添加組，肌醇的添加在一定的培養(yǎng)時(shí)間上有利于油脂的形成.同時(shí)發(fā)現(xiàn)光照和肌醇能夠影響木霉的脂類構(gòu)成.

霉菌;黑暗;肌醇;中性脂;生物柴油

微生物油脂(microbial oil)又稱單細(xì)胞油脂(single cell oil，SCO)，是由酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類等微生物在一定條件下將碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭忍荚崔D(zhuǎn)化為菌體內(nèi)大量貯存的油脂及一些具有特殊功能的脂質(zhì).某些微生物在一定條件下能將碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭绒D(zhuǎn)化為菌體內(nèi)大量貯存的油脂，如果油脂含量超過(guò)細(xì)胞干重的20%，則此微生物稱為產(chǎn)油微生物.利用產(chǎn)油微生物生產(chǎn)生物柴油是一項(xiàng)具有廣泛應(yīng)用前景的技術(shù).

1980年WIDDENP等［1］研究發(fā)現(xiàn)，木霉在土壤生物量中占有較大的比例，較易分離獲得［2］.木霉菌的許多種屬已經(jīng)被用來(lái)研究脂類物質(zhì)的產(chǎn)生，木霉所能產(chǎn)生的脂肪酸種類主要為16C飽和脂肪酸，18C單不飽和脂肪酸和18C多不飽和脂肪酸等［3］.目前國(guó)內(nèi)外利用微生物發(fā)酵作物秸稈生產(chǎn)微生物油脂存在兩大瓶頸［4］.第一，秸稈的主要成分木質(zhì)纖維素難以被降解，利用效率很低;第二，用于大規(guī)模生產(chǎn)微生物油脂的微生物一般不能利用木質(zhì)纖維素生長(zhǎng)，只能利用簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(淀粉、葡萄糖等)生長(zhǎng)發(fā)育，生產(chǎn)成本較高.因此，要想利用微生物轉(zhuǎn)化農(nóng)作物秸稈生產(chǎn)生物柴油(biodiesel)，必須首先解決好這兩方面的問(wèn)題.因此找到一種既能高效降解木質(zhì)纖維素又能將分解木質(zhì)纖維素獲得的單糖有效地轉(zhuǎn)化為脂類物質(zhì)的微生物成為解決這兩方面問(wèn)題的關(guān)鍵.研究發(fā)現(xiàn)木霉能分泌纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶，且酶穩(wěn)定性較好，并能產(chǎn)生和積累微生物油脂［5］，因此，利用木霉開(kāi)展微生物柴油的研究具有重要理論意義和實(shí)用價(jià)值.

肌醇(inositol)廣泛存在于各種天然動(dòng)物、植物及微生物組織中［6］，是一種“生物活素”，參與生物體內(nèi)的新陳代謝活動(dòng)，用于多種菌種的培養(yǎng)和促進(jìn)霉菌的增長(zhǎng)［7－8］.本文報(bào)道了光照和肌醇對(duì)木霉的脂類代謝與積累的影響.

1 材料與方法

1.1 研究材料與培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株是兩株木霉，分別標(biāo)記為L(zhǎng)1、L2，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存.研究使用GMY液體培養(yǎng)基［9－10］(1 L含KH2PO48 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Glucose 40 g，Yeast extract 3 g，調(diào) pH=5.5);GMY 液體 1 L 加瓊脂 15 ～20 g得到固體培養(yǎng)基，GMY－肌醇液體培養(yǎng)基中肌醇(過(guò)濾除菌)含量為1 mg/1mL，其它成分同GMY液體培養(yǎng)基.

1.2 研究方法

1.2.1 平板培養(yǎng)與遮光處理

取孢子懸液1小環(huán)點(diǎn)種平板中央，置培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng).L1和L2分別分成2組，正常光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng).每組接種3塊平板，分別于培養(yǎng)1 d、2 d、3 d時(shí)取出觀察菌落形態(tài)和孢子的形成情況，拍照.

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)

取GMY40液體培養(yǎng)基100 mL至250 mL三角瓶中，每瓶接種孢子量約為107個(gè)，225 rpm搖床28℃恒溫培養(yǎng).木霉L1設(shè)黑暗培養(yǎng)和添加肌醇2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，L2只做添加肌醇處理處理.

1.2.3 脂肪粒染色與觀察

搖瓶培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到1 d、2 d、3 d的時(shí)候，分別挑取不同處理方式下的菌絲體進(jìn)行蘇丹黑染色［11］顯示細(xì)胞內(nèi)脂肪粒，顯微攝影獲得圖片.根據(jù)菌絲體中脂肪粒的大小和密度定性判斷兩株霉菌在不同培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)條件下的脂肪粒積累情況.

1.2.4 生物量測(cè)定

培養(yǎng)時(shí)間分別達(dá)到1 d、2 d、3 d時(shí)，將不同處理方法的搖瓶取出，菌絲體挑取完成后，抽濾、凍干得干菌體.

1.2.5 脂肪含量測(cè)定

分別采用索氏抽提法［12］熱酸解［13］提取微生物油脂.提取的油脂經(jīng)重量分析后，用石油醚從提取瓶中溶出并定容備用.

1.2.6 油脂薄層層析(TLC)［14］

2 結(jié)果與分析

2.1 光照對(duì)兩株木霉L1、L2生長(zhǎng)和產(chǎn)脂能力的影響

正常光照處理和遮光處理對(duì)兩株木霉L1、L2生長(zhǎng)和產(chǎn)孢子能力的影響較大.如圖1所示，培養(yǎng)2 d后，L1遮光與自然光照條件下都能長(zhǎng)滿平板并出現(xiàn)成熟孢子，光照條件下生長(zhǎng)情況要快于遮光處理，成熟孢子的形成更加明顯;L2兩種處理下2 d尚未出現(xiàn)成熟孢子.培養(yǎng)3 d后，L1兩種培養(yǎng)條件下的進(jìn)一步生長(zhǎng)，成熟孢子大面積形成，但是正常光照條件仍然優(yōu)于遮光;正常光照培養(yǎng)條件下的L2已經(jīng)出現(xiàn)成熟孢子，黑暗培養(yǎng)條件下尚無(wú)成熟孢子的出現(xiàn).由L1、L2的生長(zhǎng)情況可以得知，光照條件下有利于成熟孢子的形成，光照有利于木霉的生長(zhǎng)與繁殖.

2.1.1 光照對(duì)菌株L1細(xì)胞脂肪粒形成的影響

木霉L1菌株在液體GMY震蕩培養(yǎng)時(shí)完全黑暗和正常光照不同條件下細(xì)胞內(nèi)脂肪粒的數(shù)量和大小有一定的變化.如圖2所示，經(jīng)蘇丹黑染液染色后，脂肪顆粒被染成藍(lán)黑色，顆粒的大小和多少代表油脂積累的程度.可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種處理?xiàng)l件下的油脂顆粒的體積都會(huì)變大、數(shù)量都會(huì)增多.但是同一培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)正常光照培養(yǎng)條件下L1菌絲體中的脂肪粒較遮光條件下的數(shù)量多體積大，即油脂含量高，說(shuō)明正常光照促進(jìn)油脂顆粒的形成.

2.2 肌醇對(duì)木霉L1、L2脂肪粒形成的影響

肌醇對(duì)菌株L1脂肪粒形成有一定的影響.如圖2所示，L1在GMY培養(yǎng)基和添加肌醇(1mg/1mL)的GMY培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)油脂顆粒的體積都會(huì)變大、數(shù)量都會(huì)增多.但是同一時(shí)間點(diǎn)在正常光照培養(yǎng)條件下且無(wú)肌醇添加時(shí)，L1菌絲體中的藍(lán)黑色顆粒較多，即油脂含量高，說(shuō)明肌醇的添加會(huì)減少油脂顆粒的形成.

肌醇對(duì)菌株L2脂肪粒形成有一定的影響.圖2可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，油脂顆粒體積會(huì)變大、數(shù)量會(huì)增多，并且培養(yǎng)時(shí)間分別為1 d、3 d時(shí)，均是在正常光照培養(yǎng)條件下且無(wú)肌醇添加時(shí)，L2菌絲體中的藍(lán)黑色顆粒較多，即油脂含量高，但是培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，菌株L2在以含有肌醇的培養(yǎng)基中，脂肪顆粒的體積較另一組大;培養(yǎng)時(shí)間為2 d時(shí)，菌株L2在以含有肌醇的培養(yǎng)基中，脂肪顆粒的數(shù)量較另一組多，即油脂含量高.

2.3 光照和肌醇對(duì)木霉生物量的影響

光照對(duì)L1的生物量影響不大，而肌醇對(duì)菌株L1生物量的影響在培養(yǎng)的后期較明顯.如圖3所示，菌株L1在三種處理?xiàng)l件下，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，生物量越來(lái)越多.與正常培養(yǎng)條件組相比，添加肌醇后，培養(yǎng)時(shí)間為1 d時(shí)，二者生物量無(wú)明顯差異;2 d時(shí)生物量略高于正常培養(yǎng);3 d時(shí)肌醇組生物量明顯高于正常培養(yǎng)組是前者的1.16倍.黑暗培養(yǎng)與正常培養(yǎng)相比，在不同時(shí)間點(diǎn)生物量均無(wú)較大差別.

圖1 光照對(duì)L1、L2生長(zhǎng)能力的影響Figure 1 The influence of light on growth ability of strain L1、L2

圖2 木霉L1和L2菌體細(xì)胞脂肪粒顯微圖片菌株Figure 2 Micrographs of cells with lipid globules of strain L1 and L2

肌醇對(duì)菌株L2生物量影響的較小.如圖4所示，菌株L2，在兩種處理?xiàng)l件下，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，生物量越來(lái)越多，并且添加肌醇后，在培養(yǎng)時(shí)間為2 d、3 d時(shí)，肌醇添加組生物量都略高于對(duì)照組.

2.4 光照和肌醇對(duì)木霉產(chǎn)脂能力的影響

光照和肌醇對(duì)菌株L1油脂產(chǎn)量都有明顯的抑制作用.由圖5可以看出，菌株L1在三種處理?xiàng)l件下，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，油脂產(chǎn)量越來(lái)越高，與圖2、圖3蘇丹黑染色結(jié)果吻合.與正常組相比，添加肌醇后，培養(yǎng)時(shí)間為1 d時(shí)，二者油脂產(chǎn)量無(wú)明顯差異;2 d時(shí)，正常培養(yǎng)油脂產(chǎn)量明顯高于肌醇添加組，是后者的1.97倍;3 d時(shí)是后者的的1.63倍.說(shuō)明1mg/mL肌醇的添加不利于脂肪顆粒的形成.黑暗組與正常培養(yǎng)組相比，在培養(yǎng)時(shí)間為1 d時(shí)，前者油脂產(chǎn)量略高;但是，2 d時(shí)反而正常培養(yǎng)組是遮光組的2.79倍;3 d時(shí)是遮光組的2.07倍.說(shuō)明在培養(yǎng)時(shí)間段的后續(xù)培養(yǎng)中，遮光處理不利于脂肪顆粒的形成.

圖3 光照和肌醇對(duì)L1菌株生物量的影響Figure 3 Light and inositol impact on the biomass of L1 strains

圖4 肌醇對(duì)L2菌株生物量的影響Figure 4 Inositol impact on the biomass of L2 strains

圖5 光照和肌醇對(duì)L1菌株油脂產(chǎn)量的影響Figure 5 Light and inositol impact on the lipid production of L1 strains

圖6 肌醇對(duì)L2菌株油脂產(chǎn)量的影響Figure 6 Inositol impact on the lipid production of L2 strains

圖7 索氏提取得菌株L1中性脂的薄層層析圖譜Figure 7 TLC of L1 non－polar lipids of Soxhlet extraction

CE:膽固醇脂;TAG:三油酸甘油脂(甘油三酯);DAG:二油酸甘油脂(甘油二酯);PL:磷脂;“+”表示實(shí)驗(yàn)采用該處理方式，“－”表示實(shí)驗(yàn)未采用該處理方式.

肌醇對(duì)木霉L2油脂產(chǎn)量影響呈現(xiàn)早期促進(jìn)后期抑制的現(xiàn)象，但影響程度沒(méi)有L1的大.由圖6可以看出正常培養(yǎng)油脂產(chǎn)量隨時(shí)間的增加而增高，而添加肌醇時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，油脂產(chǎn)量較2 d時(shí)低，與圖2蘇丹黑染色結(jié)果吻合.1 d時(shí)，正常組油脂產(chǎn)量是肌醇組的2.75倍;2 d時(shí)肌醇組油脂產(chǎn)量是正常組的1.33倍;3 d時(shí)，正常組油脂產(chǎn)量是添加組的1.54倍.說(shuō)明在特定的培養(yǎng)時(shí)間段肌醇在木霉產(chǎn)脂能力上的調(diào)控，對(duì)菌株L2的調(diào)控不同于菌株L1，對(duì)菌株L2的調(diào)控在早期就顯現(xiàn)出來(lái).

2.5 光照和肌醇對(duì)木霉油脂成分的影響

由圖7可以看出，三種條件下的菌株L1中油脂的主要成分是甘油三酯和磷脂，正常組甘油三酯的含量是先增加后減少，磷脂的含量是先減少后增加;與正常組相比黑暗組甘油三酯的含量是一直增加，磷脂的含量是一直減少(圖7A);與正常組組相同，添加肌醇組甘油三酯的含量也是先增加后減少，磷脂的含量卻是一直增加(圖7B).

由圖7C所示，L2在兩種條件下的菌株中油脂的主要成分是甘油三酯和磷脂，正常組甘油三酯的含量是一直增加，磷脂的含量是一直減少;與正常組相同，添加肌醇組甘油三酯的含量也是一直增加，磷脂的含量是一直減少.

3 討論

平板培養(yǎng)菌株L1在培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，兩種培養(yǎng)條件下的L1雖然都有成熟孢子形成，但是與正常光照組相比，可以明顯看出遮光培養(yǎng)條件不利于木霉成熟孢子的形成，即不利于木霉的生長(zhǎng).菌株L2的培養(yǎng)情況可以進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論.

搖瓶培養(yǎng)時(shí)，由顯微鏡下的鏡檢圖像顯示，與正常光照組相比，遮光處理下，菌絲體內(nèi)的藍(lán)黑色顆粒較少，說(shuō)明遮光處理不利于油脂顆粒的積累;從油脂量的定量分析上，2 d時(shí)，無(wú)論是定性還是定量，都可以得出遮光處理不利于油脂顆粒的積累.搖瓶培養(yǎng)條件下，對(duì)于菌株L1，與正常光照組相比，肌醇添加后菌絲體內(nèi)的藍(lán)黑色顆粒較少，說(shuō)明肌醇的添加不利于油脂顆粒的積累;從油脂量的定量分析上，無(wú)論是定性還是定量，都可以得出肌醇的添加不利于菌株L1油脂顆粒的積累.肌醇對(duì)菌株L2產(chǎn)脂能力的影響不同于L1，肌醇對(duì)菌株L2的調(diào)控在早期就顯現(xiàn)出來(lái).

進(jìn)一步研究多個(gè)木霉菌株可以驗(yàn)證上述推斷是否在木霉屬真菌有普遍性.本文只研究了黑暗條件和100 mg/100 mL肌醇濃度對(duì)菌株L1和L2生長(zhǎng)和產(chǎn)脂能力的影響，可以進(jìn)一步研究更高濃度或更低濃度的肌醇或遮光處理中給予間斷光照刺激對(duì)木霉生長(zhǎng)和產(chǎn)脂能力的影響，以找到發(fā)酵產(chǎn)脂的最佳工藝方案，從而獲得最好的微生物油脂產(chǎn)品.

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Light and inositol effect on the growth and lipid production of two trichoderma sp.strains

LIANG Feng1，WANG Li2，YUAN Ai2，SONG Zhaoqi2，LIU Xiuhua2
(1.Biorefinery Engineering Lab of Hena Province，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，China;2.Department of Life Science，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，China)

The method of microbial biosynthesis in vivo in order for the preparation of Microbial Oil is a new path in development of oil resources.In order to optimize the fermentation conditions，first，the experiment use cell morphological and cytochemical methods(Sudan Black staining)for primary screening of two Trichoderma strains under different culture conditions.The results show that:under normal lighting culture conditions ，L1 strain grows by GMY40 liquid medium for the culture medium，pH 5.5，28℃ fermentation for 3 days，bringing about microbial fat content 15.11%，the biomass 9.62 g/L，oil yield 1.45 g/L .Coordinate expression is that Light and inositol can affect the lipid composition of Trichoderma by TLC analyze method.

mycete;darkness;inositol;neutral lipide;biodiesel

2014－04－15;

2014－04－22

梁峰(1966－)，男，河南永城人，商丘師范學(xué)院教授，博士，主要從事生物質(zhì)能源的研究.

Q939.21+7

A

1672－3600(2014)06－0060－05

【責(zé)任編輯:徐明忠】