王靜，趙寧，李萌，張艷杰，張書義，滕國新，宋真，劉寧,，許曉曦

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) a.食品學(xué)院，b.乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，哈爾濱 150028；3.上海晨冠乳業(yè)有限公司，上海 201401；4.全國畜牧總站，北京 100125； 5.北京城市學(xué)院，北京100094)

0 引 言

牛乳鐵蛋白素(Bovine Lactoferrcin，LfcinB)是牛乳中的乳鐵蛋白在酸性環(huán)境條件下經(jīng)胃蛋白酶作用從N端釋放的一段多肽[1]，除了不能促進(jìn)鐵的吸收外，完全具備乳鐵蛋白生物活性[2]，可用于保健食品、藥品中，作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑并能提高人的免疫力，有抗癌的作用[3]，且在其發(fā)揮抗癌作用濃度范圍內(nèi)對人正常細(xì)胞活性沒有影響[1]。因此，LfcinB在抗腫瘤方面有相當(dāng)大的潛力。

目前關(guān)于LfcinB抗腫瘤作用研究多集中于其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用[4]，從增殖周期和分化抗原表達(dá)水平來探討LfcinB對腫瘤細(xì)胞的抑制增殖、誘導(dǎo)分化作用國內(nèi)還少有報(bào)道。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析LfcinB對Jurkat細(xì)胞增殖、分化的影響，為進(jìn)一步深入研究LfcinB抑制白血病細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化的分子機(jī)理及其在食品中的應(yīng)用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Jurkat細(xì)胞，LfcinB，RNA酶，RPMI1640培養(yǎng)基，無支原體胎牛血清，二甲基亞砜(DMSO)，NBT，雷帕霉素，CCK-8試劑盒，碘化丙啶，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD11b抗體。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將細(xì)胞在含有10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，并置于37℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2，相對飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入一定濃度梯度的LfcinB處理細(xì)胞，LfcinB的質(zhì)量濃度梯度為50，100，200 mg/L和400 mg/L， 陽性對照組培養(yǎng)液中僅加100 nmol/mL的雷帕霉素(RAPA)，以未加LfcinB刺激的對數(shù)生長期Jurkat細(xì)胞為空白對照組。

1.3 CCK-8法檢測LfcinB對Jurkat細(xì)胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的Jurkat細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，加處理因素分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育1 h，于酶標(biāo)免疫測定儀測定450 nm處的吸光值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

增殖抑制率=[(對照組-空白組)-(給藥組-空白組)]/(對照組-空白組)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測LfcinB對Jurkat細(xì)胞周期分布的影響

將Jurkat細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，加處理因素處理細(xì)胞48 h，離心去上清液，PBS洗滌一次，于70%乙醇中4℃固定細(xì)胞過夜，1 000 g離心5 min，PBS洗滌一次，加入適量的含RNase的碘化丙啶染色液，重懸細(xì)胞，37℃避光孵育30 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，并結(jié)合ModFit軟件推算出各細(xì)胞周期相細(xì)胞所占比例，并計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)[5]。

式中：G1/G0為處于G1/G0期細(xì)胞所占比例；G2/M為處于G2/M期細(xì)胞所占比；S為處于S期細(xì)胞所占比例。

1.5 NBT還原反應(yīng)檢測LfcinB對Jurkat細(xì)胞分化的影響

將濃度為1×106mL-1的Jurkat細(xì)胞懸液接種于12孔板中培養(yǎng)24 h，按100 μL/孔接種于96孔板中，設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。每孔加入含NBT 1.25 g/L及BSA 17 g/L的PBS混合液100 μL，37℃孵育2 h， 離心去上清， 加入DMSO 150 μL/孔，震蕩10 min，酶標(biāo)儀測定580 nm處OD值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞分化抗原CD11b的表達(dá)

將細(xì)胞懸液1 mL接種于12孔板中培養(yǎng)24 h，離心棄上清液。用PBS液洗滌一次，500 μL PBS液重懸后加入FITC標(biāo)記的鼠抗人CD11b抗體10 μL，4℃下避光孵育40 min，陰性對照僅加相應(yīng)PBS孵育，PBS洗滌一次，加500 μL PBS，用流式細(xì)胞儀檢測CD11b陽性率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)平行樣。用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，單因素方差分析比較各實(shí)驗(yàn)組差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCK-8法檢測LfcinB對Jurkat細(xì)胞的抑制作用

檢測LfcinB對Jurkat細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，當(dāng)作用時(shí)間相同時(shí)，隨著LfcinB濃度增加，Jurkat細(xì)胞的增殖抑制率亦隨之增加 (P＜0.01)。此外，隨著作用時(shí)間的延長，各濃度的Jurkat細(xì)胞增殖抑制率也逐漸升高(P＜0.01)。因此表明，LfcinB能顯著抑制Jurkat細(xì)胞增殖，并具有劑量和時(shí)間依賴性。

2.2 LfcinB對Jurkat細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測LfcinB對Jurkat細(xì)胞周期分布的影響，結(jié)果如圖2和圖3所示。由圖2和圖3可以看出，隨著LfcinB濃度增加，細(xì)胞在G1/G0期百分率明顯上升(P＜0.01)，而S期的細(xì)胞百分率則顯著下降(P＜0.01)，增殖指數(shù)也顯著下降(P＜0.01)(見圖4)，具有劑量依賴性。由此可見，LfcinB可抑制Jurkat細(xì)胞增殖并能將其細(xì)胞周期阻滯于G1/G0期。

2.3 NBT還原反應(yīng)檢測Lfcin B對Jurkat細(xì)胞分化的影響

將Jurkat細(xì)胞經(jīng)不同濃度LfcinB處理，然后檢測其NBT還原反應(yīng)的OD值，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，當(dāng)作用時(shí)間相同時(shí)，隨著LfcinB質(zhì)量濃度增加，OD值也隨之上升(P＜0.01)。此外，隨著作用時(shí)間的延長，各質(zhì)量濃度的OD值也隨時(shí)間的延長而提高(P＜0.01)。該OD值反應(yīng)細(xì)胞的NBT還原能力，亦間接反應(yīng)細(xì)胞的分化程度，因此以上結(jié)果說明LfcinB能誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞分化，并具有劑量和時(shí)間依賴性。

2.4 LfcinB對Jurkat細(xì)胞分化抗原CD11b表達(dá)的影響

利用流式細(xì)胞儀檢測藥物處理后細(xì)胞表面分化抗原CD11b表達(dá)水平變化，結(jié)果如圖6和圖7所示。由圖6和圖7可以看出，隨著LfcinB質(zhì)量濃度增加，Jurkat細(xì)胞表面分化抗原CD11b陽性率明顯提高 (P＜0.01)，具有劑量依賴性，表明LfcinB誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞分化的能力隨著濃度提高而增強(qiáng)。

圖3 不同質(zhì)量濃度LfcinB對Jurkat作用48 h后不同時(shí)期細(xì)胞百分率

圖4 不同質(zhì)量濃度LfcinB對Jurkat細(xì)胞增殖指數(shù)的影響

圖5 不同質(zhì)量濃度LfcinB對Jurkat細(xì)胞分化的影響

圖6 不同質(zhì)量濃度LfcinB對Jurkat細(xì)胞表面分化抗原表達(dá)的影響

圖7 不同質(zhì)量濃度LfcinB對Jurkat細(xì)胞表面分化抗原CD11b陽性率的影響

3 結(jié)果與討論

白血病是造血系統(tǒng)的惡性疾病，俗稱“血癌”，是國內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人們的健康。惡性增殖是癌細(xì)胞一大特點(diǎn)，通過抑制癌細(xì)胞無限增殖可起到潛在的預(yù)防、治療癌癥的作用。研究發(fā)現(xiàn)，口服乳鐵蛋白和乳鐵蛋白素能提高幼年和成年動物的抗癌、抗炎和抗微生物感染能力[6,7]，而使用乳鐵蛋白作用人的乳腺癌細(xì)胞可導(dǎo)致癌細(xì)胞生長受到抑制[8]，此外人宮頸內(nèi)膜的致瘤性轉(zhuǎn)化與乳鐵蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)，并伴隨著明顯的細(xì)胞增殖[9]。本研究選用Jurkat T細(xì)胞為細(xì)胞模型，研究LfcinB對其增殖的影響，發(fā)現(xiàn)LfcinB能夠明顯抑制Jurkat細(xì)胞增殖，這與上述結(jié)果一致。

細(xì)胞周期是指細(xì)胞一次有絲分裂完成開始到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程,包括G1、S、G2和M期。細(xì)胞周期失控是細(xì)胞異常增殖的重要原因之一，通過阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，可導(dǎo)致有絲分裂異?；蛲拱┘?xì)胞無法繼續(xù)分裂，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的生長。以往研究表明，乳鐵蛋白可以通過周期阻滯抑制鼻咽癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞增殖[8,10]。王雷等也研究發(fā)現(xiàn)重組人乳鐵蛋白可以阻斷口腔癌細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)G1/G0期阻滯[11]。本研究使用流式細(xì)胞儀觀察不同濃度LfcinB處理Jurkat細(xì)胞后細(xì)胞周期分布變化，發(fā)現(xiàn)處于G1/G0期的Jurkat細(xì)胞蓄積增多，處于S期細(xì)胞明顯減少，說明DNA合成受阻,細(xì)胞不能進(jìn)入分裂期，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)向非增殖細(xì)胞群。這與Wolf等研究發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白通過G1/G0期阻滯來抑制腫瘤細(xì)胞增殖的結(jié)果一致[12]。表明LfcinB可能通過阻滯Jurkat細(xì)胞于G1/G0期發(fā)揮其增殖抑制效應(yīng)。

與細(xì)胞惡性增殖、凋亡受阻一樣，細(xì)胞分化異常在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義,白血病的發(fā)生就是多能造血干細(xì)胞在發(fā)育分化的某一階段分化受阻的結(jié)果[13]。如何逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤細(xì)胞的異常分化是腫瘤研究的重要領(lǐng)域。在細(xì)胞分化過程中，細(xì)胞表面分化抗原也會相應(yīng)發(fā)生改變，CD11b為Jurkat細(xì)胞表面分化抗原，應(yīng)用單克隆抗體測定細(xì)胞表面分化抗原的表達(dá)可較精確地判斷Jurkat細(xì)胞是否發(fā)生分化。在許多組織中，細(xì)胞由增殖到分化的轉(zhuǎn)化是一個(gè)細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞分化激活相互協(xié)調(diào)的過程，人們通常認(rèn)為G1/S期阻滯可能是增殖/分化相互轉(zhuǎn)化的樞紐[14]。本研究中，NBT還原性隨著濃度增加而增強(qiáng)，而NBT的還原性也直接反應(yīng)了細(xì)胞分化程度，此外CD11b陽性率隨著質(zhì)量濃度提高增加，表明LfcinB能誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞分化，這與肖暉等研究認(rèn)為乳鐵蛋白呈時(shí)間和濃度依賴性促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞分化的結(jié)果一致[15]。

本研究初步闡明了LfcinB對Jurkat細(xì)胞增殖、分化的影響，這為LfcinB抗白血病的研究提供了實(shí)驗(yàn)支撐，為乳鐵蛋白素保健品的開發(fā)應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，但其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1]黎觀紅,張錦華,瞿明仁，等.乳鐵素-來源于乳鐵蛋白的多功能抗菌肽[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2009,25(9):796-804.

[2]胡志和,董瑩,龐廣昌,等.乳鐵蛋白和乳鐵素的抗菌活性比較[J].食品科學(xué),2005,26(8):99-102.

[3]胡志和,龐廣昌,陳慶森.牛乳鐵蛋白及乳鐵素的生產(chǎn)與應(yīng)用現(xiàn)狀[J].食品科學(xué),2006,27(6):247-250.

[4]張鐵男，楊巍，劉寧.牛乳鐵蛋白素對 Jurkat細(xì)胞和 HFL-I細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào),2009,31(5):465-469.

[5]ORMEROD M G.Flow Cytometry:A Practrcal Approach[M].New York:Oxford University Press,1990,69987.

[6]TOMITA M,WAKABAYASHI H,YAMAUCHI K,et al.Bovine lactoferrin and lactoferricin derived from milk:production and applications[J].Biochem Cell Biol,2002,80(1):109-112.

[7]TSUDA H,SEKINE K,FUJITA K,et al.Cancer prevention by bovine lactoferrin and underlying mechanisms?a review of experimental and clinical studies[J].Biochem Cell Biol,2002,80(1):131-136.

[8]DAMIENS E,YAZIDI I E,MAZURIER J,et al.Lactoferrin inhibits G1 cyclin-dependent kinases during growth arrest of human breast carcinoma cells[J].Journal of Cellular Biochemistry,1999,74(3),486–498.

[9]FARELY J,LOUP D,NELSON M,et al.Neoplastic transformation of the endocervix associated with downregulation of lactoferrin expression[J].Mol Carcinog,1997,20(2):240-250.

[10]ZHOU Y,ZENG Z,ZHANG W,et al.Lactotransferrin:A candidate tumor suppressor-deficient expression in human nasopharyngeal carcinoma and inhibition of NPC cell proliferation by modulating the mitogen-activated protein kinase pathway[J].Int.J.Can cer,2008,2065-2072.

[11]王雷,蔡妍,孫宏晨.重組人乳鐵蛋白對口腔癌細(xì)胞周期及周期因子表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2010,26(1):19-21.

[12]WOLF J S,LI G,VARADHACHARY A,et al.Oral lactoferrin results in T cell-dependent tumor inhibition of head and neck squamous cell carcinoma in vivo[J].Clin Cancer Res.2007,13:1601-1610.

[13]楊劍，糜漫天，楊志祥，等.視黃酸依賴反義cyclin D1對HL-60細(xì)胞分化效應(yīng)研究[J].免疫學(xué)雜志,2004,20(3):177-180.

[14]WANG J,BARSKY L W,SHUM C H,et al.Retinoid-induced G1 arrest and differentiation activation are associated with a switch to cyclin-dependent kinase-activating kinase hypophosphorylation of retinoic acid receptor α[J].J.Biochem,2002,277(45):43369-43376.

[15]肖暉,劉寧.乳鐵蛋白對大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化的影響[J].國際骨科學(xué)雜志,2008,29(3):198-201.