方正清， 賈鵬鵬， 許 閃， 王桐生， 吾布力·吐爾迪

(安徽中醫(yī)藥大學1護理學院， 2藥學院， 3中西醫(yī)結(jié)合臨床學院, 合肥 230038； 4新疆維吾爾醫(yī)學?？茖W校藥學系, 新疆 和田 848000)

迪娜口服液(新藥制字Z04000139)是維吾爾醫(yī)學專科學校研制的口服液制劑，其主要成分為菊苣子、菊苣根、旱芹菜子、大黃、菟絲子、菟絲草、小檗實及青香茅等10味藥材組成，具有保肝降酶、開塞通絡、增強肝膽功能的功效，對各種肝病治療具有肯定療效。李迪明等[1]研究已發(fā)現(xiàn)迪娜口服液可降低四氯化碳(CCl4)所致肝損傷酶的升高和保護肝組織，但其機制不明。湯新慧等[2]研究報道CCl4所致肝損傷中肝細胞發(fā)生凋亡是重要機制，凋亡又與氧化應激密切相關。因此，本研究探討迪娜口服液對CCl4所致肝損傷時氧化應激的作用，為CCl4所致肝損傷的機制和防治提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組昆明種小鼠60只,雌雄各半,分開飼養(yǎng)，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，購自安徽省實驗動物中心[動物合格證號：SCXK(皖)2011-002號]。小鼠適應性喂養(yǎng)5 d，自由攝食和飲水，溫度保持18～20℃，相對濕度40%～60%，定時通風換氣。隨機分成6組，稱重、標記并記錄，每組10只，6組分別為正常對照組、模型組、陽性藥聯(lián)苯雙酯組(3.75 mg/kg,相當于人10倍用量[3])及迪娜口服液低、中、高劑量組(分別為4.78、9.55、19.10 g迪娜口服液/kg體質(zhì)量，相當于人用量95.5 g/d 的5、10、20倍)。

1.2藥品與儀器四氯化碳(CCl4) (分析純AR，國藥集團化學試劑有限公司，批號20091216)，植物油(山東魯花花生油股份有限公司)，迪娜口服液(新疆新維制藥廠，批號20100201)，聯(lián)苯雙酯滴丸(北京協(xié)和藥廠，批號10120104，1.5 mg/丸，5丸/次，3次/d)，生理鹽水(安徽豐原藥業(yè)，批號121105K2)，考馬斯亮藍試劑盒(批號 20130126)、丙二醛(MDA)含量測定試劑盒(批號20130220)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量測定試劑盒(批號20130216)、Ca2+轉(zhuǎn)運ATP酶(Ca2+-ATPase) 試劑盒(批號 20130214)均購自南京建成生物工程研究所，冰乙酸(分析純AR，上海振企化學試劑有限公司，批號20100622)，無水乙醇(上?；瘜W試劑一廠，批號20100105)。UV-754分光光度計(上海第三分析儀器廠)，TDZS-WS多管架自動平衡離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，電子臺秤(上海佑科儀器儀表有限公司，編號11076040)，電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠，型號WSZ-133-65)。

1.2方法

1.2.1 急性肝損傷模型建立與處理[4]0.15%四氯化碳-花生油溶液的制備：精密量取0.15 mol/L CCl4于100 mL的容量瓶中，加花生油定容、塞緊瓶塞、倒置、混勻后即可用于實驗。將小鼠適應性喂養(yǎng)5 d后，開始實驗當日起，各實驗藥物組及陽性對照組每天分別灌胃給藥，正常對照組、模型組灌胃等體積雙蒸水。給藥期間自由飲水，普通飼料飼養(yǎng)。連續(xù)給藥7 d后，禁食不禁水12 h，各藥物組及模型組腹腔注射0.15%CCl4-花生油溶液，劑量為0.1 mL/10 g體質(zhì)量，正常對照組腹腔注射等體積花生油。

1.2.2 肝臟標本的采集及組織勻漿的制備[5]造模24 h后，脫頸椎處死動物，于同一部位摘取部分肝臟，-20℃保存，用于肝組織勻漿的制備。取保存的肝臟組織塊(0.2～1 g)用冰冷的生理鹽水解凍，漂洗，除去血液，濾紙吸干，稱重，放入5～10 mL的燒杯中。用量筒取9倍組織重量且預冷的生理鹽水，用移液管將總量2/3的生理鹽水移入燒杯，用眼科小剪盡快剪碎組織塊并倒入玻璃勻漿管中，再用剩下的1/3的生理鹽水沖洗殘余在小燒杯的碎組織一起倒入勻漿器中進行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水的器皿中，右手將桿垂直插入套管中上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)10次(6～8 min)，充分磨碎，使組織勻漿化。

1.2.3 MDA含量的測定 采用比色法(TBA法)，因脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收,故選用532 nm處測定其吸光度，算出MDA含量。(1)組織蛋白含量的測定：取上述10%肝臟勻漿，按考馬斯亮藍試劑盒說明測定蛋白含量。(2)取上述10%肝組織勻漿，按照丙二醛測試盒說明測定各管OD值。(3)參照試劑盒說明書，將測定的OD值帶入組織中MDA含量計算公式①中計算各組MDA含量。

①

1.2.4 GSH-Px活力測定 采用比色法，因GSH-Px和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸陰離子呈現(xiàn)較穩(wěn)定的黃色，在412 nm處測定其吸光度即可算出GSH-Px含量。(1)組織蛋白含量的測定：取上述10%肝臟勻漿，按考馬斯亮藍試劑盒說明測定蛋白含量。(2)將上述制備好的10%肝組織勻漿，離心，留上清液。按照GSH-Px測試盒說明測定各管OD值。(3)參照試劑盒說明書，將測定的OD值帶入組織中GSH-Px含量計算公式②中計算各組GSH-Px含量。

②

1.2.5 肝組織Ca2+-ATPase活性變化 采用比色法，ATP酶可以分解ATP生成ADP及無機磷，測定無機磷含量可判斷ATP酶活力。(1)組織蛋白含量的測定：取上述10%肝臟勻漿，按考馬斯亮藍試劑盒說明測定蛋白含量。(2)將上述制備好的10%肝組織勻漿，稀釋，按照Ca2+-ATPase測試盒說明測定各管OD值。(3)參照試劑盒說明書，將測定的OD值帶入組織中Ca2+-ATPase含量計算公式③中計算各組Ca2+-ATPase含量。

③

2 結(jié)果

與正常對照組比較，模型組肝組織MDA含量明顯升高，GSH-Px活力明顯降低(P<0.05)，Ca2+-ATPase活性顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組和迪娜各劑量組肝組織MDA含量均降低，其中迪娜高劑量組降低明顯(P<0.05)；GSH-Px各劑量組活力提高，其中高劑量組上升較為明顯；陽性對照組和迪娜各劑量組Ca2+-ATPase均有較大幅度的上升(P<0.05)，其中迪娜中劑量組Ca2+-ATPase活性增幅最大(P<0.01),見表1。

表1 迪娜口服液對急性肝損傷模型小鼠肝組織MDA含量、GSH-Px及Ca2+-ATPase活力的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05； 與模型組比較，▲P<0.05。

3 討論

有研究表明，CCl4引發(fā)的急性肝損傷產(chǎn)生過量的自由基可廣泛地損傷肝細胞，導致肝細胞壞死、肝臟脂質(zhì)大量積蓄進而導致MDA含量顯著變化[6]。這使得MDA 與細胞內(nèi)生物大分子交聯(lián)的機會變大，從而使得胞質(zhì)、線粒體、微粒體內(nèi)的各種酶活性被抑制，肝細胞因自由基造成的氧化損傷最后導致肝細胞壞死[7]。MDA是脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物，其含量與脂質(zhì)過氧化反應成正比，其含量可間接反映肝細胞損傷的程度。CCl4代謝產(chǎn)生的活性自由基CCl3-以及由其誘導產(chǎn)生的氧自由基，能使細胞膜、線粒體膜、微粒體膜等生物膜上的脂質(zhì)過氧化鏈式反應啟動，細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量增加，GSH-Px活性亦有變化。肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增加，抗氧化物酶GSH-Px活性顯著降低，表明CCl4引起急性肝損傷的機制與脂質(zhì)過氧化有關[8]。本實驗結(jié)果表明，CCl4致急性肝損傷模型小鼠組肝組織MDA含量較正常對照組有較大幅度的上升，而肝組織GSH-Px活力與Ca2+-ATPase活性有很大程度的下降。GSH作為脂質(zhì)過氧化物的清除劑，可穩(wěn)定細胞輔助因子,保護肝細胞。MDA含量的增加和GSH-Px活力的抑制提示CCl4致小鼠急性肝損傷的機制為引起脂質(zhì)過氧化反應，而Ca2+-ATPase活性的抑制也提示此過程的發(fā)生。迪娜各劑量組的肝組織MDA含量較模型組均有所下降，GSH-Px活力與Ca2+-ATPase活性均有所上升。其中，迪娜中、高劑量組肝組織MDA含量下降較為明顯，說明迪娜口服液中、高劑量對CCl4致急性肝損傷小鼠脂質(zhì)過氧化損傷抑制作用較明顯；迪娜高劑量組GSH-Px活力上升較為明顯，說明此劑量的迪娜口服液對CCl4致急性肝損傷小鼠的脂質(zhì)過氧化物的清除作用較強，提高GSH-Px活力保護肝細胞較好；迪娜中劑量組Ca2+-ATPase活性較其他實驗藥物組活力高，與正常對照組Ca2+-ATPase活性水平較為接近，說明該劑量的迪娜口服液在提高Ca2+-ATPase活性恢復受損肝細胞方面具有較好的作用。

研究認為，受損肝細胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶的釋放，使得血清中轉(zhuǎn)氨酶升高成為肝臟損傷程度的重要指標[9]。本課題組的前期研究工作顯示，迪娜口服液對CCl4致小鼠急性肝損傷有一定的保護作用，不同劑量的迪娜口服液能抑制CCl4致急性肝損傷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的升高[10]，提示CCl4致急性肝損傷模型的成功。

本實驗結(jié)果顯示迪娜口服液對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織MDA含量升高有一定的抑制作用，對肝組織GSH-Px活性及Ca2+-ATPase活力均有一定恢復作用，提示迪娜口服液對肝損傷保護的過程可能與其抗氧化作用有關。其通過降低肝過氧化物含量、提高相關抗氧化酶活性從而清除自由基，防止脂質(zhì)過氧化，穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)，起到保護肝細胞的作用。本研究結(jié)果為迪娜口服液臨床進一步應用和開發(fā)提供了一定的佐證。迪娜口服液對肝臟疾病的保護作用可能是參與肝臟脂質(zhì)過氧化過程，具體機制需進一步探究。

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