高冬梅, 龍 梅, 張 璐, 張媛媛, 古扎麗努爾·阿不力孜

(新疆醫(yī)科大學1附屬腫瘤醫(yī)院婦科, 烏魯木齊 830011; 2第一附屬醫(yī)院婦科·生殖中心, 烏魯木齊 830054)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國每年新發(fā)病例約10萬例，局部地區(qū)的發(fā)病率和死亡率有增長趨勢，其死亡率在女性惡性腫瘤中居第2位，且呈現(xiàn)患病年輕化趨勢[1]。子宮頸癌一直是新疆地區(qū)發(fā)病率居首位的婦女惡性腫瘤,尤其維吾爾族婦女子宮頸癌比例明顯高于其他民族,且發(fā)病年齡早,平均年齡為45.04歲,宮頸癌是維吾爾族婦女死亡的主要原因之一[2]。有關(guān)研究顯示，宮頸癌在新疆入院治療的惡性腫瘤患者所占的比例達20%，而維吾爾族婦女所占的比例達75%以上，其中早期患者比例甚少，治療效果良好，但是中、晚期患者居多，治療效果差[3]。目前國內(nèi)外研究已證實高危型人乳頭疾瘤病毒(HR-HPV)感染是宮頸癌的主要危險因素，尤其是高危型HR-HPV的持續(xù)感染，HPV16型感染占多數(shù)[4-6]。許多研究已證實維吾爾族婦女子宮頸癌的發(fā)生與HPV16型感染有關(guān)，維吾爾族婦女宮頸癌的高危型HPV檢出率達90%[7]。Vinokurova等[8]研究認為：與HPV31、33型比較，HPV16、18、45型更常見以整合狀態(tài)存在，HPV整合是宮頸癌的一個特點。其與癌前病變到侵襲性癌的進展密切相關(guān)，其中致癌性最強的的是HPV16、18型[9]，然而對于HPV-DNA整合狀態(tài)與宮頸細胞的惡性轉(zhuǎn)化仍是目前爭議的問題。為進一步探討新疆維吾爾族宮頸癌患者HPV-DNA在宮頸癌組織中的表達及存在狀態(tài)，本研究選擇30例經(jīng)HC2法檢測的高危型HPV陽性的宮頸癌手術(shù)切除標本，采用巢式PCR法檢測HPV16-DNA的表達，采用多重Taqman探針熒光定量PCR檢測HPV16-DNA在組織中的生存狀態(tài)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料收集新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦科2012年6月-2013年6月收治的宮頸癌患者經(jīng)HC2法檢測的高危型HPV陽性的宮頸癌手術(shù)切除標本30例，離體的新鮮組織標本于術(shù)后30 min內(nèi)放入液氮中-80℃保存?zhèn)溆茫袠吮揪?jīng)病理結(jié)果證實，且宮頸癌癌細胞數(shù)>80%。取組織前患者均未接受放化療治療，收集標本前均征得患者同意。

1.2儀器與主要試劑ABI 7500型熒光定量PCR儀 (Applied Biosystems)，組織基因組DNA提取系統(tǒng)(北京天根)，Taq DNA Polymerase(Thermo Scientific)，dNTP Mix(Thermo Scientific)，DL2000 DNA Marker(Takara)，梯度PCR儀(Bio-Rad, USA ，MyCycler Thermal Cycler)，水平電泳儀(DYCP-31DN及DYY-6C型)，核酸蛋白定量儀(北京凱奧k5500)凝膠成像系統(tǒng)(BioDoc-IT Imaging System，UVP,USA)，pCR-XL-TOPO-HPV16質(zhì)粒，TaqMan?Universal PCRMaster Mix(ABI)，TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit(Takara)，HindⅢ(NEB)，Thermo Scientific GeneJET Gel Extraction Kit(Thermo)。

1.3DNA提取按DNA提取試劑盒操作提取DNA，核酸蛋白定量儀檢測DNA濃度，A260/A280 1.6～2.0為合格，用于后續(xù)實驗，1%瓊脂糖凝膠電泳分析，其正確條帶應(yīng)為150 bp。

1.4HPV16-DNA檢出分析將提取的樣本DNA，利用巢式PCR檢測組織中HPV16-DNA的表達。使用引物GP-E6-3F和GP-E6-5R進行第1輪PCR。反應(yīng)體系總體積為25 μL：10×Taq Buffer 2.5 μL、25 mM Mg2+2 μL、10 mM dNTP 0.5 μL、5 U/μL的Taq DNA Polymerase 0.15 μL、Primer F(10 mM)(GP-E6-3F)0.5 μL、Primer R(10 mM)(GP-E6-5R) 0.5 μL、模板0.5 μL、ddH2O218.35 μL。PCR的反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，63℃ 30 s，35次循環(huán)，72℃ 5 min,反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。將上述PCR產(chǎn)物進行1∶100稀釋后，進一步使用引物HPV16Fz和HPV16Rz進行第2輪PCR，反應(yīng)體系總體積為25 μL，反應(yīng)條件同前，1%瓊脂糖凝膠電泳分析，HPV16-DNA正確條帶為457 bp。實驗所用引物由上海歐易生物工程有限公司合成，其具體序列見表1。

表1 引物序列

1.5HPV16-DNA在宮頸癌組織中的存在狀態(tài)分析

1.5.1 標準品質(zhì)粒的制備、提取、純化 按試劑盒說明進行質(zhì)粒的制備、提取、純化。pCR-XL-TOPO-HPV16質(zhì)粒由新疆大學生命科學與技術(shù)學院新疆生物資源基因工程國家重點實驗室饋贈。

1.5.2 多重Taqman探針熒光定量PCR反應(yīng) 將回收的標準品質(zhì)粒稀釋1 000倍后，按1:10倍比稀釋，10-1～10-7倍稀釋，每個稀釋梯度重復2次檢測，PCR反應(yīng)體系總體積50 μL，包括：aqMan Universal PCR Master Mix (2×) 25 μL，HPV16 E2-Forward primer (10 μM) 1 μL，HPV16 E2-Reverse primer (10 μM) 1 μL，HPV16 E2 TaqMan probe(10 μM) 1 μL，HPV16 E6-Forward primer (10 μM) 1 μL，HPV16 E6-Reverse primer (10 μM) 1 μL，PV16 E6 TaqMan probe (10 μM) 1 μL，DNA template 2 μL，RNase-free water 補至50 μL，PCR反應(yīng)條件為50℃2 min， 95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)，每個樣品設(shè)置3個復孔，以E2/E6比值表示HPV16-DNA的存在狀態(tài)。

1.6統(tǒng)計學分析所有統(tǒng)計學分析均使用SPSS 17.0軟件完成。HC2與巢式PCR 2種檢測方法對HPV-DNA陽性率的比較采用Kappa檢驗；比較宮頸癌組織中HPV16-DNA與各類臨床病理參數(shù)間的關(guān)系采用pearson χ2檢驗或Fisher精確概率法進行統(tǒng)計學檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1HPV16-DNA在宮頸癌組織中的表達在HC2檢測HR-HPV陽性的30例宮頸癌組織中利用巢式PCR檢測HPV16-DNA的檢出率為96.7%(29/30)，說明新疆維吾族宮頸癌患者中HPV感染主要是HPV16亞型感染，見圖1。采用巢式PCR與HC2方法檢測HPV-DNA的檢測結(jié)果相一致，符合率為90%，經(jīng)Kappa檢驗，P<0.05，見表2。

M：DL 2000 marker ，C1～C45為篩選DNA合格的30例宮頸癌組織標本

圖1巢式PCR檢測宮頸癌組織中的HPV16-DNA電泳圖

2.2HPV16-DNA表達與宮頸癌患者臨床參數(shù)的關(guān)系HPV16-DNA的表達水平與宮頸癌患者的年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)， 但其在病理分級高的患者中表達高于病理分級低的患者(P<0.05)，在臨床分期高的患者中表達高于低分期患者(P<0.05)，見表3。

表2 30例宮頸鱗癌HC2與巢式PCR檢測結(jié)果比較/例

注： Kappa=0.901，P<0.05。

表3 HPV16-DNA的表達與宮頸癌臨床參數(shù)的關(guān)系/例

注：*理論頻數(shù)<1， Fisher精確概率法計算的結(jié)果。

2.3HPV16-DNA在宮頸癌組織中的存在狀態(tài)分析根據(jù)HPV16 E2、E6標準曲線(圖2、3)，E2、E6的擴增效率分別為97.73%、95.07%，確定其95%的可信區(qū)間(0.807 9～1.287 5)，故確定HPV16的E2/E6界值為0.81，即E2/E6=0為HPV16整合態(tài)；E2/E6≥0.81為HPV16游離態(tài)；0

3 討論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是多因素作用的結(jié)果，除與病毒的載量、型別、變異等有關(guān)以外, 與宿主自身的免疫狀態(tài)、個體基因的HPV易感性和環(huán)境的協(xié)同因素也是非常必要的，并且有研究認為HPV的致癌作用與HPV-DNA的整合有關(guān)，整合型的HPV可以比較容易地逃逸免疫系統(tǒng)的自我清除的機制,因而可能造成HPV持續(xù)感染，改變宿主基因組，使得一些抑癌基因功能喪失，最終導致宮頸細胞的惡性轉(zhuǎn)化[10-11]。

圖2 多重taqman探針熒光定量PCR HPV16 E2基因曲線

圖3 多重taqman探針熒光定量PCR HPV16 E6基因曲線

本研究通過采用HC2及巢式PCR對30例宮頸癌組織樣本進行檢測，2種檢測方法的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。古扎麗努爾·阿不力孜等[7]對新疆維吾爾族宮頸癌患者中HPV16亞型的分布研究結(jié)果顯示新疆維吾爾族宮頸癌HPV總陽性率為83.14%，其中HPV16占91.75%，本研究結(jié)果顯示HPV16-DNA維吾爾族患者宮頸癌組織中的檢出率為96.7%(29/30)，與文獻報道結(jié)果一致，且HPV16-DNA的表達水平與宮頸癌的分化程度及臨床期別有統(tǒng)計學差異，這也進一步證實HPV16在新疆維吾爾宮頸癌中起了重要作用。多項研究顯示宮頸癌中HPV-DNA整合是宮頸癌的一個特點，與病變的進展密切相關(guān)[12-13]，但是HPV16在漢族宮頸癌人群與維吾爾族患者人群中存在狀態(tài)是否一致，目前在新疆維吾爾族宮頸癌組織中的存在狀態(tài)報道很少。鄭瑩等[14]的研究顯示,總整合率為88.9%，其中HPV16 整合態(tài)占70.4%，混合態(tài)占18.5%，游離態(tài)占11.1%。本研究結(jié)果顯示HPV16總的整合率為89.6%，與其無明顯差異，但是不同的是在新疆維吾爾族宮頸癌患者中HPV16 主要以混合態(tài)存在(55.2%)，單純整合態(tài)僅占34.2%，游離態(tài)占10.3%，提示新疆維吾爾族宮頸癌患者與漢族患者HPV16在組織中的存在狀態(tài)可能存在一定的差異，這對今后新疆宮頸癌的防治工作可能提供一個治療的方向。因為本研究的樣本含量較少，還有待進一步擴大樣本含量，以確定兩者之間的差異。

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